陶文靖 曲連海 賈晨 劉磊 高琦 小池 尹艷 王文博

摘 要：據(jù)美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)經(jīng)濟研究部門最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，沙門氏菌每年在美國導(dǎo)致的醫(yī)療花費達(dá)到37億美元，這個數(shù)據(jù)將沙門氏菌排在了美國食源性疾病花費最高的15大致病菌之首。另外，一系列沙門氏菌引起的食物中毒事件也表明，沙門氏菌早已成為全球最常見的食源性致病菌之一。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測技術(shù)存在耗時、繁瑣、低效等缺點，故快速、靈敏、可靠的新型快速檢測技術(shù)成為研究熱點。將免疫學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)有機結(jié)合，利用微生物特異性免疫磁珠和微生物測試片實現(xiàn)待檢致病菌的雙重篩選，大大提高了沙門氏菌檢測的特異性，靈敏度明顯高于同類產(chǎn)品，并大幅度縮短檢測時間。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌 食源性致病菌 免疫磁珠 測試片

世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件接連發(fā)生，食品安全形勢嚴(yán)峻，衛(wèi)生部統(tǒng)計公告的食物中毒人數(shù)逐年遞增，且食源性致病菌引起的占據(jù)首位[1]。據(jù)WHO估計，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物所引起[2]。沙門氏菌主要污染肉及肉制品、蛋制品、奶制品等，雞是沙門氏菌的天然宿主，感染了沙門氏菌的雞肉制品是引起人沙門氏菌感染的主要途徑。市場上的零售雞肉，沙門氏菌陽性檢出率高達(dá)50%。所以，開發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確的食源性致病菌快速檢測方法已成為保障食品安全和防止疾病傳染的關(guān)鍵。

1 沙門氏菌檢測方法

國標(biāo)規(guī)定，食品中沙門氏菌的檢測主要是培養(yǎng)法和生理生化檢測法，該檢測法的特點是方法經(jīng)典，但缺點是操作繁瑣、試劑繁多、耗時較長，一個完整檢測周期需要大約5～7天時間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能夠滿足檢測要求。目前，應(yīng)用較多的快速檢測法主要是即用培養(yǎng)法、免疫學(xué)法、分子生物學(xué)方法等。免疫學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢是特異性高、耗時間短、結(jié)果可靠，適合批量檢測和自動化檢測；依賴于專業(yè)儀器分子學(xué)方法的優(yōu)勢是靶標(biāo)明確、時間短、結(jié)果可靠，明顯的不足則是引物和探針的選擇及設(shè)計不當(dāng)，可能降低靈敏度和特異性[3]；技術(shù)設(shè)備要求高，熒光探針價格昂貴，另外容易造成交叉污染是核酸法不能回避的問題等。

因此，設(shè)計和開發(fā)出特異性好、檢測時間短、操作簡便的沙門氏菌快速檢測技術(shù)對于食品安全領(lǐng)域的微生物快速檢測具有重要意義。

2 磁在快沙門氏菌測試盒原理

免疫磁性分離技術(shù)，又稱為免疫磁珠法，可直接從樣品或前增菌培養(yǎng)物中分離目的細(xì)菌。磁珠上包被能夠特異識別目標(biāo)細(xì)菌的抗體，通過抗原抗體反應(yīng)從而形成一個磁珠和細(xì)菌的復(fù)合體，再通過磁場將磁珠收集使目標(biāo)菌得到有效地富集和分離[4]，大大縮短前增菌時間。

微生物測試片是應(yīng)用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法和現(xiàn)代生化鑒定技術(shù)相結(jié)合的檢測技術(shù)。測試片的載體中含有可供目標(biāo)生長的營養(yǎng)成分，選擇劑以及特異酶顯色底物，通過直接觀察菌落顏色即可對細(xì)菌種類做出鑒定，是一種簡單、方便、經(jīng)濟的檢測方法。

磁在快檢測試劑盒將兩種檢測方法結(jié)合，通過特異性免疫磁珠和微生物測試片對微生物進行雙重篩選，提高了沙門氏菌檢測的特異性。對于食品檢測中的復(fù)雜樣本，通過免疫磁珠的富集，能夠有效去除干擾檢測的雜質(zhì)，并對樣本具有濃縮作用，靈敏度明顯高于同類產(chǎn)品，大幅度縮短增菌時間，整個檢測過程在24h內(nèi)可完成。同時，操作簡單，不需要大型設(shè)備，可以節(jié)約空間、降低檢測成本。

3 磁在快沙門氏菌測試盒驗證方案

3.1 識別性和特異性

選取沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離株按照標(biāo)準(zhǔn)方法進行培養(yǎng)擴增，同時計數(shù)，稀釋到測試所需濃度（100CFU/mL）。

磁在快測試方法為：取1mL分別加入到2mL的富集管中，放置37℃，150rpm/min震蕩孵育15min，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門氏菌測試片上，37℃，培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后，計數(shù)所有測試片上顯示出藍(lán)色的菌落。

對照方法為將1mL菌液直接涂布于LB平板中，37℃培養(yǎng)24h，計數(shù)所有生長菌落。

3.2 不同菌濃度的回收效率

選取鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）按照標(biāo)準(zhǔn)方法進行培養(yǎng)擴增，同時計數(shù)，梯度稀釋，每個稀釋度取1mL，按照3.1所示方法進行測定。

3.3 不同體積的回收效率

選取鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）按照標(biāo)準(zhǔn)方法進行培養(yǎng)擴增，同時計數(shù)，稀釋到100CFU/mL，100 CFU/5mL，100 CFU/10mL，100CFU/25mL，按照3.1所示方法進行測定。

3.4 生鮮乳和豬肉中沙門氏菌的檢測方法

生鮮乳樣品20份，采自北京某奶廠，4℃進行保藏；豬肉樣品20份，購于北京某批發(fā)市場。

生鮮乳：取樣品25mL，加入磁珠，震蕩15min，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門氏菌測試片上，37℃，培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后，計數(shù)所有測試片上顯示出藍(lán)色的菌落。

豬肉：取樣品25g，用20mLBPW均質(zhì)，將均質(zhì)液加入磁珠富集管中，37℃，震蕩4h，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻，磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門氏菌測試片上，37℃，培養(yǎng)18h。培養(yǎng)結(jié)束后，計數(shù)所有測試片上顯示出藍(lán)色的菌落。

對照方法：取樣25g，按照GB 4789.4-2010的方式進行測定。

4 結(jié)果分析

4.1 識別性和特異性

通過檢測，磁在快檢測系統(tǒng)對沙門氏菌A、B、C、D、E不同血清型及常見沙門氏菌均可以有效富集及擴增（富集率>75%），對干擾菌大腸桿菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌均能有效的抑制（均未生長），方法識別性和特異性良好。

4.2 不同菌濃度的回收效率

經(jīng)測定，初始菌濃度為1.3×106CFU/mL，通過不同菌濃度測試，磁在快檢測系統(tǒng)磁珠富集容量大于5×105CFU/mL，同時菌濃度處于10～105CFU/mL時，菌的回收率均大于85%。

4.3 不同體積的回收效率

結(jié)果顯示，隨著體積的增大，磁在快檢測方法的回收率略有下降，從91.6%下降為78.8%，但是回收率仍大于75%，符合測試要求。

4.4 生鮮乳和豬肉中沙門氏菌的檢測方法

檢測樣本也同時采用了國標(biāo)法對樣本進行對比檢測，本實施例中的測試結(jié)果與國標(biāo)法檢測結(jié)果一致。各樣本的定性檢測結(jié)果如表4所示。實驗結(jié)果顯示20例豬肉樣本中有5例檢出含有沙門氏菌，20例牛奶樣本有0例檢出含有沙門氏菌。

經(jīng)過比對，4份樣品磁在快方法和GB 4789.4-2010方法一致，1份不一致從磁在快測試片挑取菌落經(jīng)鑒定為沙門氏菌。

5 結(jié)論

通過實驗驗證，磁在快檢測方法對沙門氏菌的捕獲率均在80%以上，并有較高的特異性；免疫學(xué)結(jié)合生物化學(xué)技術(shù)快檢方法與國標(biāo)法相比較，測試結(jié)果與國標(biāo)法檢測結(jié)果一致，準(zhǔn)確性無顯著性差異，靈敏度達(dá)到10個cfu以下。測試片可直接觀察菌落顏色即可對菌類做出鑒定，是一種高效、精準(zhǔn)、操作簡單的檢測方法。免疫學(xué)結(jié)合生物化學(xué)技術(shù)快檢方法優(yōu)化了食品安全檢測人員的工作方式，提高工作效率和檢測可信度，對于中國食品安全的發(fā)展具有重大意義。

6 展望

食源性致病菌檢測技術(shù)在不斷的發(fā)展和創(chuàng)新過程中，每種技術(shù)都有各自的優(yōu)勢。多種技術(shù)的聯(lián)用可大大提高檢測的靈敏度，并縮短檢測時間。隨著微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，各種多功能微生物檢測系統(tǒng)的研發(fā)正逐步成為熱點。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫秀蘭，蔣棟磊，張銀志.生物傳感器應(yīng)用于食源性致病菌檢測研究進展[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2011，23（11）：1040-1042.

[2] Groundwater P W，Todd A，Worsley A J，et al. The technology andtechniques used in the detection of pathogenic bacteria[J].Pharmaceuticaljournal，2009，283（7569）：281-282.

[3] 石曉路，扈慶華，張佳峰，等.多重實時PCR 快速同時檢測沙門菌和志賀菌[J].中華流行病學(xué)雜志，2006，27（12）：1053-1056.

[4] Fitzmaurice J， Duffyb G， Kilbride B， et al. Comparison of a membrane surface adhesion recovery method with an IMS method for use in a polymerase chain reaction method to detect Escherichia coli O157：H7 in minced beef[J]. Journal of microbiological methods，2004，59：243-252.