孫冰冰 楊秀榮 郝永娟 李偉 魏軍 田濤

摘 要：為提高生防芽孢桿菌的發(fā)酵水平，利用響應(yīng)面法對生防枯草芽孢桿菌B579進(jìn)行固相發(fā)酵條件優(yōu)化，以建立一套適合生防芽孢桿菌的固相發(fā)酵技術(shù)體系。首先通過Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出對發(fā)酵產(chǎn)量影響顯著的重要因素，然后進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大菌體產(chǎn)量值區(qū)域，通過Box-Behnken和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到回歸模型，并對回歸模型進(jìn)行回歸分析和實(shí)踐驗(yàn)證。結(jié)果表明：對發(fā)酵產(chǎn)量影響顯著的3個(gè)重要因素為牛肉膏、玉米粉和可溶性淀粉，當(dāng)其濃度分別為15.1、10.3 g/kg和9.14 g/kg時(shí)，發(fā)酵水平達(dá)到最高，為1.93×10¹¹cfu/g，比液相發(fā)酵水平提高了15倍；經(jīng)驗(yàn)證該模型準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞：生防芽孢桿菌；固相發(fā)酵；響應(yīng)面法

中圖分類號：S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）05-0062-05

Abstract To enhance the fermentation level of biocontrol Bacillus， the solid-state fermentation conditions of Bacillus subtilis B579 were optimized using response surface methodology to establish the related technology system. Firstly， the Plackett-Burman experiment was applied to screen the importan influential factors， and then the path of steepest ascent was used to approach the biggest region of the cell yield. Moreover， the Box-Benhnken experimental design and response surface methodology were employed to get the regression model， which was proved through regression analysis and practice verification. The results showed that the three factors affecting fermentation production were beef extract， corn meal and soluble starch. The fermentation production reached the highest as 1.93×10¹¹cfu/g， when the content of beef extract， corn meal and soluble starch were 15.1， 10.3 and 9.14 g/kg respectively. Under the optimized fermentation conditions， the solid fermentation production of biocontrol Bacillus increased by 15 times compared to the liquid fermentation. The regression model was verified to be accurate and reliable.

Key words Biocontrol Bacillus； Solid-state fermentation； Response surface methodology

一直以來，化學(xué)農(nóng)藥及肥料的使用對于植物病蟲害防治和提高農(nóng)作物產(chǎn)量品質(zhì)起到重要作用，但大量有害化合物的使用造成了土壤和地下水的嚴(yán)重污染，對生物及人類的生存也造成了嚴(yán)重危害。在過去的幾十年中，世界各國都在努力開發(fā)可替代傳統(tǒng)化學(xué)藥劑控制植物病蟲害的新方法，利用微生物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行生物防治，被公認(rèn)為是一種環(huán)境友好型的選擇。微生物生防菌劑的研究與開發(fā)已成為生物防治的一個(gè)重要內(nèi)容。芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢生物種群，許多性狀優(yōu)良的菌株表現(xiàn)出對多種植物病原菌的拮抗作用[1～3]。生防芽孢桿菌目前已在水稻、玉米、小麥、大豆、辣椒、棉花、番茄等農(nóng)作物上顯示出較好的病害防治效果[4]。芽孢桿菌被認(rèn)為是最有希望的微生物菌劑候選菌群，并且進(jìn)行了廣泛研究[5～7]。市場上的生防芽孢桿菌制劑多采用液相深層發(fā)酵技術(shù)。液相深層發(fā)酵投資大、成本高、技術(shù)要求高、產(chǎn)生廢液多、污染嚴(yán)重[8，9]。而固相發(fā)酵整個(gè)發(fā)酵過程與微生物在自然環(huán)境中所發(fā)生的微生物反應(yīng)相似，可以利用工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的副產(chǎn)品進(jìn)行發(fā)酵[10]，避免了液相發(fā)酵原材料價(jià)格較高的不足，從而降低了生產(chǎn)成本，此外發(fā)酵過程能耗低，沒有廢物排放，且適宜工業(yè)化生產(chǎn)，日益受到人們重視。

本研究以降低生產(chǎn)成本、促進(jìn)生防菌劑的推廣使用、減少化學(xué)農(nóng)藥使用為目的，以生防芽孢桿菌為供試菌株，利用農(nóng)產(chǎn)品加工過程中的副產(chǎn)物菇渣（廉價(jià)且易獲得）、麥麩、豆渣作為固體發(fā)酵基質(zhì)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化生防芽孢桿菌的固相發(fā)酵工藝，提高發(fā)酵水平，以建立一套適合生防芽孢桿菌的固體發(fā)酵技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 生防枯草芽孢桿菌B579，由天津市植物保護(hù)研究所糧經(jīng)病害研究室提供。生防芽孢桿菌TB1301、TB1336、TB1340、TB1363，由天津市植物保護(hù)研究所植病生防研究室從土壤中分離得到，對土傳病害（辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、瓜果腐霉菌Pythium aphanidermatum）有很好的拮抗作用。經(jīng)16S rRNA分子鑒定，TB1340菌株初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌[11]，TB1301、TB1336和TB1363菌株的鑒定工作正在進(jìn)行。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：蛋白胨10.00 g/L，酵母膏浸粉5.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，瓊脂粉 20 g/L，pH調(diào)至6.8～7.2，121℃滅菌30 min；液體種子培養(yǎng)基：蛋白胨 10.00 g/L，酵母膏浸粉5.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，pH調(diào)至6.8～7.2，121℃滅菌30 min；固相發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：稱取一定量蘑菇殘?jiān)橹鳎?、麥麩、大豆殘?jiān)捌渌绊懸蛩兀ň唧w參數(shù)參見表1），pH調(diào)至6.8～7.2，加入一定量水至沒有流動(dòng)水相，121℃滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌體增殖方法 刮取LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24 h的生防芽孢桿菌B579接種到30 mL液體LB培養(yǎng)基中，于溫度為37℃、搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下培養(yǎng)12～16 h，作為種子液備用。然后以3%～5%的接種量接種到固相發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃靜置培養(yǎng)72 h，每24 h搖晃一次。

1.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可以用最少試驗(yàn)次數(shù)估計(jì)出主效應(yīng)因素，適用于從眾多的試驗(yàn)因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素。根據(jù)芽孢桿菌生長所需要的營養(yǎng)條件，通過查閱文獻(xiàn)及前期試驗(yàn)，選取10個(gè)影響因素，每個(gè)影響因素取高（+）、低（-）兩個(gè)水平，以菌體產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，采用中心點(diǎn)為3、N=15的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)。各參數(shù)及其水平見表1。

1.2.3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)（steepest ascent design） 最陡爬坡試驗(yàn)以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值大小確定變化步長，能快速經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果各顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定步長及變化方向，正效應(yīng)因素取較高值，負(fù)效應(yīng)因素取較低值。

1.2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)確定出3個(gè)關(guān)鍵因素對響應(yīng)值有重要影響，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以（-1，0，1）編碼，根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)后，對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到包括一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和交互項(xiàng)的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值。經(jīng)回歸擬合，各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響可以用下列函數(shù)表示：

1.2.5 回歸模型擬合優(yōu)化的驗(yàn)證 通過響應(yīng)面優(yōu)化方法得到的最優(yōu)固相發(fā)酵條件，對生防芽孢桿菌B579以及本實(shí)驗(yàn)室由蔬菜根際土壤分離的對土傳病害具有較好拮抗作用的芽孢桿菌TB1301、TB1336、TB1340、TB1363進(jìn)行回歸模型可靠性驗(yàn)證。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，對應(yīng)的響應(yīng)值取平均值。

1.2.6 生防芽孢桿菌固相發(fā)酵水平測定 生防芽孢桿菌固相發(fā)酵水平以其菌體量來測定，采用細(xì)菌菌落總數(shù)測定法[12]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Design-expert.v 8.0.6進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響芽孢桿菌固相發(fā)酵水平的重要因素篩選

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果見表2。Plackett-Burman試驗(yàn)各因素參數(shù)分析見表3。從表3的概率值（P<0.0001）大小可以看出，對枯草芽孢桿菌固相發(fā)酵水平具有顯著影響的因素是牛肉膏（X1）、玉米粉（X4）和可溶性淀粉（X6），可作為主要因素考慮進(jìn)一步做響應(yīng)面試驗(yàn)。其中牛肉膏（X1）為負(fù)效應(yīng)因子，在進(jìn)一步的最陡爬坡試驗(yàn)中取其較小值，玉米粉（X4）和可溶性淀粉（X6）為正效應(yīng)因子，因此在最陡爬坡試驗(yàn)中均取其較大值。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

表4中列出了顯著影響因子的變化方向、步長及其試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明：菌體產(chǎn)量在0～0+4△之間先明顯上升后開始下降，當(dāng)牛肉膏為15.5 g/kg、玉米粉為10.0 g/kg、可溶性淀粉為9.1 g/kg時(shí)固相發(fā)酵水平達(dá)到最大，為三因素的最大響應(yīng)值區(qū)域，故以此條件為進(jìn)一步響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果確定3個(gè)重要因子的最佳濃度范圍后，以牛肉膏為15.5 g/kg、玉米粉為10.0 g/kg、可溶性淀粉為9.1 g/kg為試驗(yàn)中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子編碼水平見表5，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

利用軟件Design-expert.v 8.0.6對Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到生防芽孢桿菌固相發(fā)酵水平對牛肉膏、玉米粉及可溶性淀粉的二次多項(xiàng)式回歸方程：

擬合回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9823，說明該回歸模型可以解釋98.23%的試驗(yàn)所得的B579固相發(fā)酵水平，表明回歸方程擬合良好，可用于預(yù)測生防芽孢桿菌固相發(fā)酵水平的實(shí)際情況。

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)（P<0.05，見表7）得知，模型項(xiàng)X1、X4、X6、X4X6、X42、X62對回歸模型影響顯著。

圖1、圖2和圖3繪制了回歸方程的三維響應(yīng)面分析圖及對應(yīng)的等高線圖，每個(gè)響應(yīng)面分別代表兩個(gè)獨(dú)立影響因子間的相互作用，而此時(shí)第三個(gè)因子保持在編碼0的水平。從響應(yīng)面圖可以看出：在固相發(fā)酵試驗(yàn)中，牛肉膏、玉米粉和可溶性淀粉的添加濃度和發(fā)酵水平存在顯著相關(guān)性，同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)兩兩影響因子之間存在一定相互作用，對發(fā)酵水平的影響不是直觀的線性關(guān)系。根據(jù)回歸方程在各影響因子取值范圍內(nèi)求解最優(yōu)值得出，在X1、X4 和X6的值分別為15.1、10.3 g/kg和9.14 g/kg時(shí)，發(fā)酵水平達(dá)到最高，為1.93×10¹¹cfu/g。

2.4 響應(yīng)面模型驗(yàn)證

根據(jù)回歸方程得出的固相發(fā)酵水平的極值點(diǎn)進(jìn)行模型驗(yàn)證，在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下對本實(shí)驗(yàn)室自有菌株TB1301、TB1336、TB1340、TB1363進(jìn)行固相發(fā)酵小試，所得發(fā)酵產(chǎn)量分別為1.94×10¹¹、1.92×10¹¹、1.93×10¹¹、1.93 ×10¹¹cfu/g。經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化的發(fā)酵條件下的固相發(fā)酵水平與建立的響應(yīng)面模型的預(yù)測值1.93×10¹¹cfu/g相接近，證明響應(yīng)面法優(yōu)化生防芽孢桿菌的固相發(fā)酵條件可行，所建立的回歸方程可靠。

3 結(jié)論與討論

相比傳統(tǒng)的液相深層發(fā)酵方法，固相發(fā)酵技術(shù)在生防芽孢桿菌研究中的應(yīng)用越來越多。本試驗(yàn)通過響應(yīng)面分析法對生防芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)上的回歸模擬和預(yù)測，經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、高效地得到最優(yōu)發(fā)酵條件。研究結(jié)果表明，牛肉膏、玉米粉和可溶性淀粉的濃度分別為15.1、10.3 g/kg和9.14 g/kg時(shí)，生防芽孢桿菌固相發(fā)酵水平達(dá)到最高，為1.93×10¹¹cfu/g。相比枯草芽孢桿菌B579液相發(fā)酵水平1.23×10¹⁰cfu/mL提高了15倍[13]。經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)室自有菌株TB1301、TB1336、TB1340、TB1363固相發(fā)酵小試充分驗(yàn)證了回歸模型的可靠性、準(zhǔn)確性，不僅說明了利用響應(yīng)面法優(yōu)化生防芽孢桿菌固相發(fā)酵工藝可行，而且其所建立的固相發(fā)酵技術(shù)體系對生防芽孢桿菌具有普遍適用性。生防芽孢桿菌固相發(fā)酵條件的優(yōu)化，為生防菌的中試發(fā)酵生產(chǎn)與示范提供了技術(shù)支持，有效推動(dòng)了生防菌劑的開發(fā)和應(yīng)用。

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