賓珍蘭 湯丹峰 周瑞陽

摘 要 運(yùn)用方差分析、多重比較、正交實(shí)驗(yàn)和極差分析方法，對牛角瓜花粉的萌發(fā)和花粉管生長進(jìn)行研究，結(jié)果表明，培養(yǎng)基內(nèi)硼酸、硝酸鈣、蔗糖、硫酸鎂在一定濃度范圍內(nèi)，對花粉萌發(fā)及花粉管生長起促進(jìn)作用，但濃度過高或過低時(shí)，則有抑制作用；鉀對花粉萌發(fā)及花粉管生長影響不顯著；蔗糖和硝酸鈣對牛角瓜花粉萌發(fā)有顯著影響，蔗糖和硫酸鎂對牛角瓜花粉管生長有顯著影響；牛角瓜最適花粉液體培養(yǎng)基為：15% 蔗糖+350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+60 mg/L H3BO3+150 mg/L MgSO4·7H2O；在30～35℃溫度條件下，牛角瓜花粉塊萌發(fā)和花粉管生長最好。

關(guān)鍵詞 牛角瓜 ；花粉 ；花粉管生長 ；離體萌發(fā) ；生長條件

中圖分類號 S567.19 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.05.014

Abstract Pollen germination and pollen tube growth of Calotropis gigantea was tested by using One-Way ANOVA， multiple comparison， an orthogonal experiment and range analysis The results indicated that the pollen germination and pollen tube growth would be enhanced when the concentration of borate， calcium nitrate， magnesium sulphate and sucrose of the culture medium were within a certain range. When the concentration is too high or low， the pollen germination and pollen tube growth would be inhibited. Potassium has little impact on pollen tube growth and pollen germination. Sucrose and calcium nitrate have significant effect on pollen germination， sucrose and magnesium sulphate have significant effect on pollen tube growth. The optimum culture medium and environment conditions which support the germination and growth are 15% sucrose+350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+60 mg/L H3BO3+150 mg/L MgSO4·7H2O. The pollen germination and the growth of pollen tube will be better under 30～35℃.

Keywords Calotropis gigantea. ； pollen ； pollen tube ； germination in vitro ； growth conditions

牛角瓜（Calotropis gigantea）屬蘿藦科牛角瓜屬植物，又名斷腸草、五狗臥花。牛角瓜屬植物有6種，廣泛分布于亞洲和非洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]。中國有1種，生于低海拔向陽坡及空曠地，主要分布于四川、廣西、廣東、海南及云南等地[2]。牛角瓜作為一種傳統(tǒng)的藥用植物，其根、莖、葉和果等均可藥用，具有消炎、抗菌、化痰和解毒抗癌等作用[3-4]。同時(shí)其乳汁具有強(qiáng)心保肝[5-6]、鎮(zhèn)痛消炎[7-8]等療效，樹皮可治癲癬。牛角瓜纖維是種子附屬物，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，由于其具有纖維細(xì)長、中空度大、能抑菌、纖維表面有光澤等顯著特點(diǎn)，可作為一種新型的植物纖維開發(fā)利用[9-10]。目前，對牛角瓜纖維的研究主要集中在栽培種植管理上[11-12]，而對牛角瓜育種及花粉塊萌發(fā)的相關(guān)研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)以牛角瓜為研究材料，探究其花粉塊的離體萌發(fā)及花粉管生長條件，為牛角瓜花粉保存和優(yōu)良品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

牛角瓜花采集于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)地，取盛開的牛角瓜花藥中成熟的花粉塊供實(shí)驗(yàn)用。

1.2 方法

采用液體培養(yǎng)法，參照B-K[13]試液[10%蔗糖，100 mg/L H3BO3，300 mg/L Ca（NO3）2·4H2O，200 mg/L MgSO4·7H2O，100 mg/L KNO3]，將試驗(yàn)培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿中，花粉塊從花藥中取出置于培養(yǎng)基上，放入33℃人工氣候箱中培養(yǎng)，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.1 培養(yǎng)條件

用B-K試液進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)間、溫度梯度對牛角瓜花粉塊離體培養(yǎng)條件影響的試驗(yàn)。培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為2、4、6、8 h；溫度設(shè)為5、10、15、20、25、30、35、40℃。

1.2.2 培養(yǎng)基單組分篩選

試驗(yàn)參照B-K試液中的5個(gè)組分，單一組分濃度改變，其余4組分參照B-K試液濃度。分別設(shè)置以下處理：蔗糖濃度梯度分別為 0、5%、10%、15%、20%、30%；H3BO3濃度梯度分別為0、20、40、60、80、100、120、150 mg/L；Ca（NO3）2·4H2O濃度梯度分別為0、100、200、300、400 mg/L；MgSO4·7H2O濃度梯度分別為0、50、100、150、200、250、300 mg/L；KNO3濃度梯度分別為0、40、80、120、150 mg/L。

1.2.3 最佳培養(yǎng)基的選擇

根據(jù)單組分篩選結(jié)果，選擇對牛角瓜花粉塊離體培養(yǎng)影響顯著的因子，并根據(jù)所選因子的最佳濃度水平的前后2個(gè)濃度（單因素試驗(yàn)中的濃度）來確定該影響因子的濃度，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)各個(gè)正交實(shí)驗(yàn)的花粉塊萌發(fā)率和花粉管長度，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選擇最佳牛角瓜花粉塊離體培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對花粉離體培養(yǎng)的影響

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間

牛角瓜花粉粒聚集形成花粉塊，人為破損單散出來的花粉粒不萌發(fā)，自然條件下以花粉塊為單位萌發(fā)。培養(yǎng)時(shí)間不同，花粉萌發(fā)率和花粉管長度有差異，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，花粉塊萌發(fā)率增大，花粉管長度增加（圖1-A，1-B）。培養(yǎng)6 h后，花粉塊萌發(fā)率可達(dá)84.43%，方差分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)6與8 h萌發(fā)率無顯著差異（p>0.05）；花粉管依然在生長，且花粉管會出現(xiàn)胼胝質(zhì)塞。

2.1.2 溫度

溫度影響花粉塊萌發(fā)率及花粉管生長，如（圖2-A、2-B）。溫度在10℃以下，花粉不萌發(fā)。到達(dá)35℃時(shí)，花粉塊萌發(fā)率達(dá)到最大值97.78%，此時(shí)花粉管長度也達(dá)到最大值1.06 cm。40℃后，萌發(fā)率降到24.4%，花粉管長度僅0.08 cm。方差分析結(jié)果表明：萌發(fā)率和花粉管長度在30和35℃時(shí)無顯著差異（p>0.05），因此，最適培養(yǎng)溫度在30～35℃。

2.2 不同培養(yǎng)基組分對花粉塊離體培養(yǎng)的影響

2.2.1 蔗糖

從（圖3-A、3-B）可知，隨著培養(yǎng)基內(nèi)蔗糖濃度增加，花粉塊萌發(fā)率逐漸增大。當(dāng)濃度達(dá)到15%時(shí)，花粉塊萌發(fā)率達(dá)到最大值93.33%；但濃度超過30%時(shí)，對花粉塊的萌發(fā)有抑制作用。蔗糖能促進(jìn)花粉管生長，蔗糖濃度達(dá)到5%時(shí)，花粉管長度達(dá)到0.96 cm，是對照（培養(yǎng)基內(nèi)不加蔗糖）的19.2倍，方差分析結(jié)果表明：萌發(fā)率在15%濃度下與對照、5%、10%、30%的濃度存在顯著差異（p<0.05），花粉管在15%蔗糖濃度下，除與對照有顯著差異外，與其他濃度均無顯著差異（p<0.05）。綜合分析蔗糖的最適濃度為15%。

2.2.2 硼酸

在一定濃度范圍內(nèi)，花粉塊萌發(fā)率隨培養(yǎng)基內(nèi)H3BO3濃度的增加而增加，但超過一定濃度時(shí)，H3BO3對牛角瓜花粉塊萌發(fā)率和花粉管生長有抑制作用。花粉塊萌發(fā)率最高的H3BO3濃度為80 mg/L，萌發(fā)率達(dá)到93.33%（圖4-A）。低濃度H3BO3對牛角瓜花粉管長度影響不大，但濃度超過150 mg/L時(shí)會抑制花粉管生長（圖4-B）。方差分析結(jié)果表明，H3BO3濃度在80和100 mg/L時(shí)，萌發(fā)率無顯著差異（p>0.05），而花粉管長度在80和100 mg/L濃度時(shí)長勢較好。因此，H3BO3的最佳濃度為80～100 mg/L。

2.2.3 鈣

在一定濃度范圍內(nèi)，隨鈣濃度的增加，花粉萌發(fā)率增大，超過一定濃度后，萌發(fā)率下降（圖5-A）。鈣離子濃度為300 mg/L，花粉塊萌發(fā)率最大為95.57%；鈣離子濃度達(dá)到一定值時(shí)能促進(jìn)花粉管的生長（圖5-B）。方差分析結(jié)果表明：在鈣離子濃度為300 mg/L時(shí)，花粉萌發(fā)率與其他濃度的有顯著差異（p<0.05）；鈣離子濃度在300 mg/L時(shí)，與對照和鈣離子濃度為100 mg/L有顯著差異，而與200、400 mg/L無顯著差異。因此，選擇最佳鈣離子濃度為300 mg/L。

2.2.4 鎂

鎂對花粉塊萌發(fā)的影響與硼酸具有相同的趨勢。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著鎂濃度的增加，花粉塊萌發(fā)率增大，超過一定濃度后，萌發(fā)率下降（圖6-A）；鎂離子濃度為200 mg/L，花粉塊萌發(fā)率最大，為91.10%。鎂離子濃度達(dá)到250 mg/L后會抑制花粉管伸長（圖6-B）。方差分析結(jié)果表明：在鎂離子濃度為200 mg/L時(shí)，花粉塊萌發(fā)率和花粉管長度與其他濃度有顯著差異（p<0.05）。因此，鎂的最佳濃度為200 mg/L。

2.2.5 鉀

鉀在濃度梯度實(shí)驗(yàn)中并未表現(xiàn)出促進(jìn)和抑制花粉塊萌發(fā)率的狀況（圖7-A、7-B），因此，鉀對牛角瓜花粉塊萌發(fā)影響不顯著。

2.3 牛角瓜花粉塊正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析可知，最佳蔗糖濃度為15%，鈣離子的最適濃度為300 mg/L，鎂離子的最適濃度為200 mg/L，硼的最適濃度是80 mg/L，鉀離子對花粉萌發(fā)無顯著影響，因此選定前4個(gè)作為影響因子，并根據(jù)各因子的最佳濃度左右的2個(gè)濃度（單因素試驗(yàn)中設(shè)定的濃度），各個(gè)因素設(shè)定3個(gè)濃度水平，即蔗糖濃度選擇了10%、15%、20%；Ca（NO3）2·4H2O濃度250、300、350 mg/L；MgSO4·7H20濃度150、200、250 mg/L；H3BO3濃度60、80、100 mg/ L；用SPSS18設(shè)計(jì)L9（34）的正交試驗(yàn)（表1）。

根據(jù)影響花粉萌發(fā)率的正交試驗(yàn)極差分析與方差分析，結(jié)果顯示（表2）：蔗糖濃度的第一個(gè)水平濃度K1 的萌發(fā)率98.67%大于第二個(gè)水平濃度K2的萌發(fā)率93.47%大于第三個(gè)水平濃度K3萌發(fā)率 89.98%，同樣，鈣離子3個(gè)濃度水平對萌發(fā)率影響結(jié)果順序?yàn)镵3（97.75%）>K1（93.52%）>K2（90.89%）；3個(gè)濃度水平的鎂離子對萌發(fā)率影響結(jié)果為K1（96.67%）>K2（94.29%）>K3（91.16%）；硼酸對萌發(fā)率影響結(jié)果為K3（94.58%）>K2（94.27%）>K1（93.26%）。在K1～K3濃度區(qū)間內(nèi)，蔗糖和鈣離子較鎂與硼酸影響差異顯著，4個(gè)因素對萌發(fā)率的影響，極差分析與方差分析結(jié)果相同，即鈣離子>蔗糖>鎂離子>硼酸，此時(shí)，培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為鈣離子K3+蔗糖K1+鎂離子K1+硼酸K3，即350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+10%蔗糖+150 mg/L MgSO4·7H20+100 mg/L H3BO3。

同理，影響花粉管生長的正交試驗(yàn)極差分析與方差分析結(jié)果（表3）顯示：蔗糖3個(gè)濃度水平對花粉管生長影響順序?yàn)镵3（0.93 cm）>K2（0.90 cm）>K1（0.69 cm）；鈣離子為K3（0.88 cm）>K1（0.85 cm）>K2（0.79 cm）；鎂離子為K1（0.96 cm）>K2（0.80 cm）>K3（0.76 cm）；硼酸為K1（0.85 cm）=K2（0.85 cm）>K3（0.82 cm）。且在K1～K3濃度區(qū)間內(nèi)，蔗糖和鎂較鈣離子與硼酸影響差異顯著，4個(gè)因素對花粉管生長影響順序?yàn)檎崽?鎂>鈣>硼酸；各因素的最佳組合為鈣K3+蔗糖K3+鎂K1+硼酸K1，即350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+20%蔗糖+150 mg/L MgSO4·7H20+60 mg/L H3BO3。

綜合4個(gè)因素的正交試驗(yàn)對花粉萌發(fā)與花粉管的生長，鈣離子選擇濃度水平K3；鎂離子濃度水平選定為K1；硼酸濃度在K1～K3對花粉萌發(fā)率影響不顯著。因此，選擇的濃度水平為K1；蔗糖濃度對花粉萌發(fā)率與花粉管生長的影響綜合分析，選定濃度為K2。因此，培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為：15%蔗糖+350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+150 mg/L MgSO4·7H20+60 mg/L H3BO3。

3 討論

3.1 培養(yǎng)條件對花粉萌發(fā)的影響

培養(yǎng)基條件對花粉萌發(fā)和花粉管生長有顯著的影響。溫度過低或過高時(shí)也對花粉萌發(fā)和花粉管生長起抑制作用，甚至不萌發(fā)。牛角瓜花粉離體培養(yǎng)的最適溫度在30℃～35℃。牛角瓜花期全年，但盛果期為7～8月。由此可以推測，溫度是影響其結(jié)實(shí)率的重要因素之一。

牛角瓜花粉塊在離體培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)6 h后，花粉管末端膨大，開始出現(xiàn)胼胝質(zhì)塞，這可能與離體培養(yǎng)無法完成授精而停止生長，以減少物質(zhì)能量的耗損有關(guān)[14]。

3.2 培養(yǎng)基成分對花粉萌發(fā)的影響

蔗糖作為碳源，能為花粉萌發(fā)和花粉管的生長提供營養(yǎng)，并能維持外界環(huán)境的滲透壓，是許多植物花粉離體培養(yǎng)所必需的重要成分[15]。不同植物花粉離體培養(yǎng)基所需的蔗糖濃度不同，如桃[16]、高叢越橘[17]花粉離體培養(yǎng)基蔗糖的最適濃度為10%，黃連木[18]花粉離體培養(yǎng)基蔗糖的最適濃度為15%，薄殼山[19]核桃花粉離體培養(yǎng)基蔗糖的最適濃度為20%。本研究牛角瓜花粉離體培養(yǎng)基蔗糖最適濃度為15%。

一般情況下，花粉自身所含的硼和鈣是不足的，自然條件下由柱頭和花柱內(nèi)的硼和鈣來補(bǔ)償[20]。硼酸是通過與花粉管膜中果膠物質(zhì)作用改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)來調(diào)節(jié)花粉管的生長[20-22]。百合[23]花粉離體培養(yǎng)中，硼酸的最適濃度為1 mmol/L，臘梅[24]花粉萌發(fā)的最適硼酸濃度是50 mg/L。本研究中，牛角瓜花粉萌發(fā)硼酸最適濃度為80 mg/L；硼酸對牛角瓜花粉萌發(fā)率有促進(jìn)作用，但對花粉管生長影響不顯著，這個(gè)結(jié)論與杜紀(jì)紅[16]等對桃花花粉萌發(fā)研究結(jié)果一致。

鈣是花粉萌發(fā)與花粉管生長最重要的信號，一般認(rèn)為，胞外鈣離子通過質(zhì)膜鈣通道進(jìn)入花粉內(nèi)起作用，影響花粉萌發(fā)與花粉管生長[26]。梨花[25]花粉離體培養(yǎng)的最適鈣質(zhì)量濃度為15% CaCl2，核桃[27]花粉萌發(fā)的最適鈣離子濃度為40 mg/L CaCl2，本研究牛角瓜花粉萌發(fā)的最適鈣濃度為350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O。

本研究鉀對牛角瓜花粉萌發(fā)沒有顯著影響，此結(jié)論與吳開志[27]等研究鉀對核桃花粉萌發(fā)影響以及權(quán)秋梅等對淫羊藿[28]花粉萌發(fā)的結(jié)論一致。

在花粉離體培養(yǎng)中，培養(yǎng)基不同組分對花粉萌發(fā)與花粉生長的影響是不同的，硼酸淫羊藿[28]對花粉萌發(fā)有顯著影響，鈣則在蔗糖與硼酸主導(dǎo)下起輔助作用，鎂對其花粉萌發(fā)無影響。本試驗(yàn)培養(yǎng)組分中蔗糖和鈣對牛角瓜花粉萌發(fā)和花粉管的生長有顯著影響，硼與鎂在蔗糖和鈣的主導(dǎo)作用下起輔助作用。牛角瓜花粉離體培養(yǎng)的最佳液體培養(yǎng)基為：15%蔗糖+350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+80 mg/L H3BO3+150 mg/L MgSO4·7H20。

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