王偉偉　(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

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尼羅羅非魚(yú)cyp17a2生物信息學(xué)和雌雄性腺表達(dá)差異分析

王偉偉(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

摘要[目的]進(jìn)一步研究尼羅羅非魚(yú)cyp17a2的編碼蛋白的P450c17-Ⅱ的生物學(xué)特征以及在性腺中的表達(dá)特點(diǎn)。[方法]根據(jù)NCBI網(wǎng)站上登錄的尼羅羅非魚(yú)的cyp17a2基因全編碼序列，利用相關(guān)的生物信息學(xué)分析軟件分析cyp17a2基因編碼的P450c17-Ⅱ的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并分析該基因在不同性腺中的表達(dá)。[結(jié)果]羅非魚(yú)cyp17a2基因編碼的多肽含有521個(gè)氨基酸，pI為8.09，脂溶指數(shù)為98.33，是不穩(wěn)定蛋白。羅非魚(yú)cyp17a2基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)以不規(guī)則卷曲所占比例最大，為58.16%，α-螺旋占22.07%。P450c17-Ⅱ是二次跨膜蛋白，有眾多蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)。在60日齡性腺中，cyp17a2在精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢。[結(jié)論]cyp17a2在尼羅羅非魚(yú)不同性腺中的差異表達(dá)和編碼P450c17-Ⅱ的生物信息學(xué)分析為研究cyp17a2在繁殖過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞尼羅羅非魚(yú)；cyp17a2；性腺；生物信息學(xué)

性類(lèi)固醇激素在大多數(shù)脊椎動(dòng)物的繁殖中發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞色素P450c17是類(lèi)固醇激素生物合成通路的重要酶，具有17，20-裂解酶活性和17a-羥基化酶活性[1]。

在哺乳動(dòng)物和低等脊椎動(dòng)物中只發(fā)現(xiàn)1種P450c17，而在一些硬骨魚(yú)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)了2種不同基因編碼的細(xì)胞色素P450c17s，為P450c17-I 和P450c17-Ⅱ[2]，它們分別由cyp17和cyp17a2所編碼。P450c17-I具有17，20裂解酶和17a-羥化酶活性，而P450c17-Ⅱ僅具有17a-羥化酶活性。很多魚(yú)類(lèi)的cyp17 基因已經(jīng)得到克隆，而cyp17a2基因只在部分魚(yú)類(lèi)中得到克隆[3]。

對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的編碼魚(yú)類(lèi)特有的cyp17a2的表達(dá)做過(guò)相關(guān)的研究，在牙鲆的成年魚(yú)中cyp17a2的表達(dá)量在頭腎組織中最高，其在卵巢、精巢和腦中的表達(dá)量次之，而在其他組織中未檢測(cè)到[4]。在半滑舌鰨中，cyp17a2基因在卵巢中的時(shí)間表達(dá)與性腺發(fā)育呈正相關(guān)，而在精巢中的時(shí)間表達(dá)與性腺發(fā)育呈負(fù)相關(guān)[5]。

尼羅羅非魚(yú)是世界性的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，cyp17a2基因已經(jīng)被克隆[6]，并發(fā)現(xiàn)其在頭腎和性腺表達(dá)。在8月齡羅非魚(yú)精巢的間質(zhì)細(xì)胞上有表達(dá)，在卵巢中僅在前卵黃期卵母細(xì)胞的膜細(xì)胞上有表達(dá)。在卵母細(xì)胞成熟周期中，cyp17a2對(duì)卵母細(xì)胞的成熟是必需的，其表達(dá)模式與芳香化酶一致。

作為甾體激素合成通路中重要的酶，利用生物信息學(xué)的方法全面分析羅非魚(yú)cyp17a2基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和功能，有助于獲取該基因更多的信息。2月齡的羅非魚(yú)雌雄幼魚(yú)分別處于精子發(fā)生和卵黃積累的關(guān)鍵時(shí)期。筆者根據(jù)NCBI網(wǎng)站上登錄的尼羅羅非魚(yú)的cyp17a2基因全編碼序列，利用相關(guān)的生物信息學(xué)分析軟件分析cyp17a2基因編碼的P450c17-Ⅱ的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并對(duì)該階段雌雄性腺中cyp17a2的表達(dá)進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究cyp17a2在魚(yú)類(lèi)繁殖過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1羅非魚(yú)cyp17a2基因編碼的蛋白的生物信息學(xué)分析

1.1.1羅非魚(yú)cyp17a2序列的獲取。從NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載羅非魚(yú)cyp17a2基因的CDS區(qū)序列(NM_001279458)和氨基酸序列。

1.1.2序列的生物學(xué)信息分析。利用表1中的軟件和在線(xiàn)工具，分析cyp17a2編碼蛋白的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)、二級(jí)結(jié)構(gòu)等。

1.2cyp17a2基因在尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)雌雄性腺中的表達(dá)差異

1.2.1試驗(yàn)動(dòng)物和試劑。試驗(yàn)采用60日齡的雌雄尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)各6尾，經(jīng)麻醉后解剖取出性腺組織，置于液氮中進(jìn)行速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)mRNA的提取。RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒，均購(gòu)自大連TaKaRa公司。

1.2.2方法。

1.2.2.1mRNA的提取及cDNA第一鏈的合成。按照mRNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取mRNA，測(cè)定mRNA的OD值后，取500 ng mRNA根據(jù)說(shuō)明書(shū)(TaKaRa，Japan，DRR036A)要求合成cDNA第一鏈。

1.2.2.2引物的設(shè)計(jì)和熒光定量。根據(jù)NCBI網(wǎng)站上登錄的羅非魚(yú)cyp17a2基因CDS全長(zhǎng)序列(NM_001279458)和18S rRNA序列(JF698683.1)，利用NCBI網(wǎng)站上的Primer blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/)在線(xiàn)軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物，引物序列如表2所示。根據(jù)熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)液，使用ABI 7500 熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

2結(jié)果與分析

2.1羅非魚(yú)cyp17a2基因編碼蛋白生物信息學(xué)分析

2.1.1羅非魚(yú)cyp17a2編碼的蛋白的基本理化性質(zhì)。羅非魚(yú)cyp17a2 CDS區(qū)有1 563 bp堿基對(duì)，編碼521個(gè)氨基酸。通過(guò)ProtParam程序?qū)α_非魚(yú)cyp17a2氨基酸序列進(jìn)行基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，羅非魚(yú)cyp17a2編碼氨基酸的等電點(diǎn)(pI)為8.09，說(shuō)明該基因編碼的蛋白質(zhì)為堿性蛋白。羅非魚(yú)cyp17a2的脂溶指數(shù)為98.33，說(shuō)明羅非魚(yú)cyp17a2是一種脂溶蛋白。羅非魚(yú)cyp17a2的總平均親水性為-0.048，為親水性蛋白。羅非魚(yú)cyp17a2的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，是一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.1.2羅非魚(yú)cyp17a2蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及酶重要的功能區(qū)。HMMTOP 顯示該蛋白有2個(gè)跨膜區(qū)，位于17～34和55～74，N-端位于外側(cè)，TMHMM-2.0軟件也顯示該蛋白有2個(gè)跨膜區(qū)(圖1)，說(shuō)明該蛋白處于細(xì)胞膜上。在cyp17a2編碼的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)P450c17保守的特有區(qū)域、Ozols tridecapeptide 區(qū)域(參與類(lèi)固醇底物結(jié)合)和細(xì)胞色素P450 cysteine heme-iron 信號(hào)區(qū)域(圖2)。

2.1.3羅非魚(yú)cyp17a2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)。使用SignalP 4.0軟件，預(yù)測(cè)cyp17a2蛋白質(zhì)的信號(hào)肽，輸出S、C、Y3個(gè)值，其最大C分值為0.189(紅線(xiàn)表)，最大S分值(綠線(xiàn))為0.725，最大Y分值(藍(lán)線(xiàn))為0.320(圖3)，說(shuō)明該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽。

2.1.4羅非魚(yú)cyp17a2蛋白O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。對(duì)氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析，羅非魚(yú)cyp17a2氨基酸序列中第43、291、292、298、299、364、445、448位點(diǎn)潛力值都大于0.5的閾值，是潛在的O-糖基化位點(diǎn)，表明羅非魚(yú)cyp17a2的氨基酸序列中存在8個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。

2.1.5羅非魚(yú)cyp17a2蛋白N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。從圖4可以看出，位于246位點(diǎn)的天冬酰胺(Asn)的N-糖基化潛力值為0.550 9，大于閾值(0.5)，則這個(gè)天冬酰胺為N-糖基化位點(diǎn)。

2.1.6羅非魚(yú)cyp17a2蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。從圖5可以看出，羅非魚(yú)crp17a2的氨基酸序列中有18個(gè)絲氨酸(Ser)和3個(gè)蘇氨酸(Thr)的磷酸化潛力值均大于閾值(0.5)，表明羅非魚(yú)cyp17a2存在21個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

2.1.7羅非魚(yú)cyp17a2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。從圖6可以看出，羅非魚(yú)cyp17a2基因編碼的521個(gè)氨基酸所組成的蛋白質(zhì)中α-螺旋占22.07%，包括115個(gè)氨基酸；延伸鏈占19.77%，由103個(gè)氨基酸組成；不規(guī)則卷曲所占比例最大，為58.16%，包括303個(gè)氨基酸。

2.2cyp17a2基因在尼羅羅非魚(yú)幼魚(yú)雌雄性腺中的表達(dá)差異以18SrRNA為內(nèi)參基因，通過(guò)Real-time PCR對(duì)尼羅羅非魚(yú)的雌雄性腺cyp17a2 基因表達(dá)量進(jìn)行了分析，方差分析表明，該基因在雌雄性腺中表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)，雄魚(yú)顯著高于雌魚(yú)(P<0.05)(圖7)。

3結(jié)論與討論

該研究中以尼羅羅非魚(yú)的cyp17a2編碼的氨基酸序列為研究對(duì)象，對(duì)其功能進(jìn)行分析。cyp17a2編碼蛋白為脂溶性蛋白，也是堿性蛋白，比較穩(wěn)定。疏水作用是蛋白質(zhì)折疊的重要驅(qū)動(dòng)力，是分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的重要一步。該蛋白雖有跨膜區(qū)，只有1個(gè)二次跨膜區(qū)域，在整個(gè)序列中占的比例很小，因此仍表現(xiàn)出親水性。該蛋白有多個(gè)糖基化位點(diǎn)增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在cyp17a2編碼的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了P450c17保守的特有區(qū)域、Ozols 十三肽區(qū)(參與類(lèi)固醇底物結(jié)合)和細(xì)胞色素P450 cysteine heme-iron 信號(hào)區(qū)域，這些區(qū)域與羅非魚(yú)cyp17以及其他脊椎動(dòng)物的cyp17編碼的氨基酸序列高度保守[15]。人類(lèi)的Arg358(精氨酸)對(duì)P450c17的裂解酶活性是必須的[16]，在硬骨魚(yú)類(lèi)P450c17-Ⅰ和其他脊椎動(dòng)物P450c17的Arg358位于Ozols tridecapeptide region里，而在條斑星鰈[2]和羅非魚(yú)的P450c17-Ⅱ的該位置不是Arg，而是Asn代替，這可能解釋P450c17-Ⅱ只有羥化酶活性，而沒(méi)有裂解酶活性的原因。

在牙鲆[4]、半滑舌鰨[5]和條斑星鰈[2]中，cyp17a2在多種魚(yú)類(lèi)的性腺中有表達(dá)，在半滑舌鰨卵巢中，cyp17a2的時(shí)間表達(dá)模式與發(fā)育呈正相關(guān)，而在精巢內(nèi)表達(dá)與性腺發(fā)育呈負(fù)相關(guān)，顯示不同的表達(dá)模式。在半滑舌鰨處于Ⅳ期的雌雄性腺中，精巢cyp17a2的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于卵巢。

該試驗(yàn)中在60日齡的尼羅羅非魚(yú)的幼魚(yú)雌雄性腺中均檢測(cè)到cyp17a2的表達(dá)。此時(shí)，尼羅羅非魚(yú)性腺正分別處于卵黃積累和精子發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期，P450c17-Ⅱ的羥化酶活性在這2件重要生理事件中的作用很重要。在P450c17-Ⅱ的羥化酶活性作用下孕酮轉(zhuǎn)化為17α-羥孕酮，然后在不同酶的作用下分別生成雌二醇(E2)和17α，20β-DHP，它們?cè)诼殉卜謩e對(duì)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和卵母細(xì)胞最終成熟是必不可少的；在精巢孕激素能啟動(dòng)精子發(fā)生、誘導(dǎo)精子成熟和排精，也是間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)雄激素合成的關(guān)鍵酶。因?yàn)镻450c17-Ⅱ缺乏裂解酶活性，在羅非魚(yú)性別分化的起始階段(5日齡)不表達(dá)，在8日齡在雌魚(yú)起始表達(dá)來(lái)啟動(dòng)17α，20β-DHP的合成，12日齡在顆粒細(xì)胞達(dá)到高峰[6]。在日本鰻鱺[17]，17α，20β-DHP對(duì)其精子發(fā)生減數(shù)分裂起始很關(guān)鍵。在羅非魚(yú)中cyp17a2的起始表達(dá)與減數(shù)分裂一致。60日齡羅非魚(yú)卵巢減數(shù)分裂已經(jīng)完成，處于卵黃積累的階段，而此時(shí)精巢處于精子發(fā)生減數(shù)分裂的前期，高表達(dá)的cyp17a2對(duì)17α，20β-DHP產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，從而起始減數(shù)分裂，因而在精巢高表達(dá)。在斑馬魚(yú)中也發(fā)現(xiàn)cyp17a2的表達(dá)與卵巢發(fā)育負(fù)相關(guān)，而與精巢發(fā)育正相關(guān)。該研究結(jié)果有助于進(jìn)一步分析cyp17a2基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)以及在魚(yú)類(lèi)繁殖活動(dòng)中的作用。

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Bioinformatics Analysis ofcyp17a2 in Nile Tilapia and Differences of Expression in Gonads

WANG Wei-wei

(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801)

Key wordsNile tilapia;cyp17a2; Gonads; Bioinformatics

Abstract[Objective] In order to study the biological characteristics of tilapia P450c17-Ⅱ coded bycyp17a2, and expression characteristics in gonads. [Method] The physicochemical properties and construction features were analyzed using biology softwares, according to coding sequence of tilapiacyp17a2 from NCBI, andcyp17a2 expression in different gonads were analyzed. [Result] The complete coding region of tialapia encoded 521 amino acid residues. The theoreticalpIand aliphatic index was 8.09 and 98.33, respectively. P450c17-Ⅱ was basic, fat-soluble and unstable protein. Random coil was most popular in the secondary structure, and was 58.16%, alpha helix accounted for 22.07%. P450c17-Ⅱ was transmembrane, and there were a lot of post-translation modified sites in P450c17-Ⅱ. The expression ofcyp17a2 was higher in testis than in ovary in 60d tilapia. [Conclusion] The differentiation expression ofcyp17a2 in different gonads of Nile tilapia and P450c17-Ⅱ bioinformatics analysis can lay a foundation for researching the role ofcyp17a2 in propagation process.

基金項(xiàng)目山西農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2010025)。

作者簡(jiǎn)介王偉偉(1979- )，女，山西晉城人，講師，碩士， 從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳與育種研究。

收稿日期2016-02-26

中圖分類(lèi)號(hào)S 937.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)07-103-04