摘 要：為了深入研究魚類snrpc基因的作用機(jī)制，通過分析斑馬魚snrpc的發(fā)育時(shí)序表達(dá)，來探討snrpc基因在斑馬魚中的功能機(jī)理。從斑馬魚的胚胎中提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、PCR、克隆等，得到snrpc基因在胚胎發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在斑馬魚胚胎發(fā)育初期，snrpc表達(dá)量較高，隨著胚胎的不斷發(fā)育，snrpc的mRNA表達(dá)量有所下降，到后期表達(dá)量又上升。因此，snrpc表達(dá)量的變化可能預(yù)示著snrpc發(fā)揮功能的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)snrpc的克隆和表達(dá)分析，為后續(xù)進(jìn)一步研究其相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；時(shí)序表達(dá)；snrpc

中圖分類號(hào) S965.299 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）08-14-02

Abstract：In order to further study the mechanism of snrpc in fish，we analysed the temporal expression of snrpc to explore the potential function of snrpc gene in zebrafish.In this study，the total RNA was extracted from zebrafish embryos，then cDNA was synthesized by reverse transcription. The snrpc gene was amplified successfully by PCR. The temporal expression pattems of ssnrpc among embryonic development were analyzed by RT-PCR. Results showed that the snrpc mRNA were mainly transcribed in the initial development of zebrafish embryos. With the embryonic development，the snrpc mRNA decreased.In the late stages of embryonic development，the mRNA rise again. Therefore，the changes may indicate that high mRNA level stages are the key periods. The cloning and expression characterization of snrpc laid the foundation for the further study of gene function.

Key words：Zebrafish；Temporal expression；Snrpc

snRNP蛋白在mRNA前體剪切中發(fā)揮著重要的功能[1-2]。本實(shí)驗(yàn)室在斑馬魚卵巢文庫中擴(kuò)增到一種snrpc基因。研究證明在兩棲類的卵細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有SNRPC蛋白，但在魚類中，僅在鯽魚中有報(bào)道，但未作深入研究[3-5]，在魚類中SNRPC蛋白如何發(fā)揮功能仍是未知數(shù)。在本研究中，通過分析斑馬魚snrpc的發(fā)育時(shí)序表達(dá)，來探討其在斑馬魚發(fā)育過程中的功能機(jī)理，以期填補(bǔ)這方面研究的空白。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 斑馬魚的胚胎培養(yǎng) 斑馬魚（Danio rerio）置于（28±1）℃的水循環(huán)系統(tǒng)中進(jìn)行養(yǎng)殖。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 Sequi-Gen電泳儀系統(tǒng)，Bio-RabGONGSI公司；PCR儀，Bio-RabGONGSI公司；定量移液器，法國Glison公司；Bio-RabGONG-SI公司，凝膠成像系統(tǒng)，高速冷凍離心機(jī)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)公司；超凈工作臺(tái)；低溫水浴鍋；恒溫水浴鍋；恒溫?fù)u床，上海精宏實(shí)驗(yàn)公司。

1.1.3 主要試劑 PCR taq酶，TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶，NEB公司；PCR純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、酶切膠回收試劑盒，上海生工；T4連接酶購，Promega；KOD kit，TOYOBO。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 斑馬魚snrpc的克隆 （1）RNA的提?。唬?）mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；（3）PCR擴(kuò)增目的基因snrpc。

將PCR的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將與預(yù)期一致的條帶回收，連接、轉(zhuǎn)化及陽性克隆鑒定。

1.2.2 mRNA表達(dá)水平檢測

1.2.2.1 各個(gè)時(shí)期胚胎RNA的提取和cDNA的合成 和前面總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA的方法一樣，各個(gè)時(shí)期的胚胎各取50～100mg。

1.2.2.2 RT-PCR檢測mRNA水平 RT-PCR中用到的引物如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 snrpc基因克隆的結(jié)果及序列分析 用oligo dT引物逆轉(zhuǎn)錄合成mRNA的第一鏈cDNA。根據(jù)NCBI上預(yù)測的snrpc的全基因序列，設(shè)計(jì)引物，以第一鏈cDNA為模板PCR擴(kuò)增snrpcc的ORF序列，得到與預(yù)期大小一致的條帶（如圖1）。由圖1可知，在500bp與250bp之間的400bp處存在較亮條帶與目的DNA條帶大小相符，擴(kuò)增片段正確?；厥蘸螅瑢⒃撈芜B接到pGEM-T vector上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，挑取單克隆，通過菌液PCR鑒定陽性克隆，測序結(jié)果顯示與預(yù)期一致。snrpc的cDNA全長為398bp，包含3個(gè)部分，一個(gè)282bp的開放閱讀框（ORF），編碼94個(gè)氨基酸，長度為52bp的5′非編碼區(qū)（5′-UTR，5′-untranslated region），長度為64bp的3′非編碼區(qū)（3′-UTR，3′-untranslated region），有一個(gè)多聚腺苷酸加尾信號(hào)AATAA和一個(gè)多聚腺苷酸尾巴。

2.2 snrpc在胚胎發(fā)育不同時(shí)期的mRNA水平 為了進(jìn)一步探究snrpc在斑馬魚胚胎發(fā)育各時(shí)期中所發(fā)揮的作用，本節(jié)中通過RT-PCR反應(yīng)研究了在斑馬魚胚胎發(fā)育不同時(shí)期mRNA水平（如圖2）。首先提取了不同發(fā)育時(shí)期胚胎的總RNA，通過mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，β-actin作為內(nèi)參，以cDNA為模板，用β-actin引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，確保提取的各時(shí)期RNA的逆轉(zhuǎn)錄效率大體一致，再以snrpc的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳檢測，反應(yīng)出胚胎發(fā)育各時(shí)期mRNA的表達(dá)量。

如圖2，通過RT-PCR，檢測到snrpc在斑馬魚早期不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，斑馬魚snrpc從受精后0h開始有表達(dá)，且表達(dá)量較高，在4hpf開始表達(dá)量降低，隨后的6～9hpf表達(dá)量最低，基本檢測不到。12hpf時(shí)短暫升高，之后的12～24hpf表達(dá)量再次降低，從36hpf之后表達(dá)量再次升高并維持在相對(duì)較高并穩(wěn)定的水平。因此，斑馬魚snrpc為母源性基因，且在早期胚胎發(fā)育過程中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)表達(dá)。

3 討論

為了研究snrpc基因在斑馬魚中發(fā)揮的功能，克隆得到了snrpc基因的ORF序列。通過RT-PCR研究結(jié)果表明，snrpc mRNA在斑馬魚不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況則都呈現(xiàn)出一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，在斑馬魚胚胎發(fā)育初期，snrpc表達(dá)量較高，可能參與了此階段的mRNA前體的剪切加工。隨著胚胎的不斷發(fā)育，snrpc的mRNA表達(dá)量有所下降，受精后6～9h完全檢測不到，這說明母源基因的耗盡。到后期表達(dá)量又上升，尤其是12h含量很高，說明snrpc很可能在這個(gè)時(shí)期發(fā)揮重要作用。同時(shí)這也說明對(duì)snrpc的表達(dá)調(diào)節(jié)是一個(gè)多層次、多方面的調(diào)控過程，確保snrpc在斑馬魚生長發(fā)育過程中的精確表達(dá)。

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（責(zé)編：張宏民）