王紅瑩+方瑞

摘 要：為了深入研究魚類RNA剪接相關(guān)基因snrpc的作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR研究了斑馬魚成魚組織中snrpc mRNA的表達(dá)模式，并比較分析了鯽魚中snrpc的表達(dá)。結(jié)果顯示，斑馬魚snrpc在垂體和卵巢中有表達(dá)，而鯽魚中在腎臟、垂體和卵巢中有表達(dá)，表明snrpc在不同魚類中具有組織表達(dá)的差異性。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；snrpc；組織表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S965.299 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）08-21-02

Abstract：In order to further study the mechanism of fish's snrpc relevant to RNA splicing，we researched the expression of mRNA in zebrafish's and crucian carp's tissues by RT-PCR. Zebrafish's snrpc expression in the pituitary and oocyte，while the crucian carp's expression in kidney pituitary and oocyte. Preliminary results show that zebrafish's snrpc has specific expression in different tissue.

Key words：Zebrafish；Snrpc；Tissue distribution

在負(fù)責(zé)RNA剪切的因子中，snRNP蛋白是最關(guān)鍵的一類。SNRPC是snRNP蛋白中的一種，但至今研究仍較少。在魚類早期發(fā)育過程中，細(xì)胞的快速分裂需要RNA的正確剪切，推測(cè)SNRPC在此過程中發(fā)揮著重要的功能。本研究中應(yīng)用RT-PCR研究斑馬魚以及經(jīng)濟(jì)魚類鯽魚成魚組織中snrpc mRNA的表達(dá)模式，以期進(jìn)一步揭示SNRPC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）實(shí)驗(yàn)品種：斑馬魚、鯽魚。（2）主要儀器及設(shè)備：Sequi-Gen電泳儀系統(tǒng)，Bio-RabGONGSI；定量移液器，Gilson；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-RabGONGSI；PCR儀，Bio-RabGONGSI；恒溫?fù)u床、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、低溫水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、恒溫水浴鍋，上海精宏。（3）主要試劑：PCR taq酶，TaKaRa；限制性內(nèi)切酶，NEB；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒、酶切膠回收試劑盒，上海生工；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TOYOBO。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 snrpc基因引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI上預(yù)測(cè)的snrpc的全長(zhǎng)序列，利用primer 5.0設(shè)計(jì)引物。

1.2.2 mRNA及蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

1.2.2.1 斑馬魚及鯽魚中各組織總RNA的提取及cDNA合成 斑馬魚和鯽魚各10條，分別取心臟、肝臟、腎臟、脾臟、脂肪、肌肉、垂體、下丘腦、端腦、小腦、延髓、精巢、卵巢50～100mg，各加600μL TRIZOL；研磨并靜置3min，加氯仿抽提，離心后將上清液轉(zhuǎn)到新Rnase-free EP管中，在管中加入等體積的異丙醇沉淀；用75%乙醇洗滌，最后溶于Rnase free的ddH2O中。提取的RNA加入oligo dT引物，70℃孵育后加入RNA酶抑制劑1μL，dNTP 5μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，42℃逆轉(zhuǎn)錄，得到各組織cDNA。

1.2.2.2 RT-PCR檢測(cè)mRNA水平 RT-PCR中使用到的引物如下：

PCR擴(kuò)增后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 snrpc在斑馬魚成魚各組織中mRNA的表達(dá) 通過提取各組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以α-tubulin作為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)，確保逆轉(zhuǎn)錄效率一致，再利用snrpc引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳鑒定斑馬魚成魚各組織中mRNA水平，結(jié)果見圖1。由圖1可知，瓊（下轉(zhuǎn)130頁）（上接21頁）脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果，斑馬魚snrpc在垂體和卵巢中均有表達(dá)，且條帶大小正確清晰，表達(dá)量相當(dāng)。

2.2 snrpc在鯽魚成魚各組織中mRNA的表達(dá) 由于斑馬魚各組織的特異性，筆者設(shè)計(jì)出一組對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即在鯽魚成魚各組織中檢測(cè)snrpc mRNA的表達(dá)，其結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，鯽魚中snrpc mRNA在腎臟、垂體和卵巢中有表達(dá)。此結(jié)果與斑馬魚中不同。不同魚的snrpc在不同組織中表達(dá)，具有不同的生物學(xué)功能。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果，斑馬魚中在P（垂體）和T（精巢）中有明顯的條帶，且條帶大小正確清晰，說明斑馬魚snrpc mRNA在垂體和精巢中具有組織特異性。而在鯽魚中，在K（腎臟）和P（垂體）、T（即精巢）中有明顯的條帶，說明鯽魚snrpc mRNA在腎臟、腦和精巢中具有組織特異性。魚類snrpc基因?qū)儆诓町惐磉_(dá)基因，不同物種中具有不同的表達(dá)模式。據(jù)研究，snrpc基因在不同組織中表達(dá)的差異性與其RNA剪接活性有一定關(guān)系。此外，一些因子也和SNRPC共同作用并且參與了RNA的剪切。比如，轉(zhuǎn)錄因子EWS和其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，再和SNRPC作用來進(jìn)行RNA剪切的調(diào)節(jié)。TIA-1因子和U1 C蛋白共同作用后，可促進(jìn)snRNP的剪接效率。SNRPC的N末端可以和谷氨酸富含區(qū)域的C末端產(chǎn)生互作。當(dāng)然，要想了解snrpc基因在體內(nèi)的功能還需通過基因敲除等技術(shù)，進(jìn)一步研究其蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，以揭示其在機(jī)體內(nèi)的作用。

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（責(zé)編：張宏民）