王小妹，陳　頌，陳瀅宇，胡　燕，張曉宇，寧興旺，朱惠斌*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，湖南長沙410007；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州510405；3.湖南省第二人民醫(yī)院手足外科，湖南長沙410007）

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中藥復(fù)方提取物HNA-1對(duì)SIV慢性感染恒河猴胸腺輸出及胸腺細(xì)胞發(fā)育的影響

王小妹1，陳頌2，陳瀅宇2，胡燕1，張曉宇3，寧興旺1，朱惠斌*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，湖南長沙410007；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州510405；3.湖南省第二人民醫(yī)院手足外科，湖南長沙410007）

〔摘要〕目的探討中藥復(fù)方提取物湘A-1號(hào)方（HNA-1,湖南省艾滋病防治小組推薦免費(fèi)使用的兩個(gè)中藥復(fù)方之一的提取物）治療HIV-1感染及艾滋?。ˋcquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS）的療效機(jī)制。方法用8只已感染猴免疫缺陷病毒SIVmac239 16～21個(gè)月的中國恒河猴，治療組采用2個(gè)月的HNA-1治療；對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)采集外周血提取DNA，采用定量PCR檢測T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)（T cell receptor excision circles, TRECs）來評(píng)價(jià)胸腺輸出功能；并用酶消化法分離胸腺細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測胸腺內(nèi)CD34+前體細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞發(fā)育各階段的比例改變。結(jié)果與模型對(duì)照組比較，HNA-1治療組胸腺細(xì)胞輸出明顯增加（P<0.05）；且胸腺內(nèi)CD34+Lin-細(xì)胞比例明顯增加（P< 0.05），胸腺雙陽性T細(xì)胞（Double positive，DP）Ⅱ階段比例減少，而DPⅢ和DPⅣ階段比例均增加。結(jié)論HNA-1對(duì)艾滋病的療效可能與其能顯著增加胸腺輸出有關(guān)；其作用機(jī)制可能涉及增加胸腺內(nèi)前體細(xì)胞數(shù)量、以及促進(jìn)胸腺細(xì)胞細(xì)胞從DPⅡ階段發(fā)育至DPⅢ等。

〔關(guān)鍵詞〕湘A-號(hào)方；CD4+T細(xì)胞；胸腺輸出；胸腺細(xì)胞發(fā)育

艾滋病毒和宿主免疫系統(tǒng)的相互作用是艾滋病發(fā)病的關(guān)鍵因素。CD4+T是機(jī)體T細(xì)胞的重要功能群體，在機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，是HIV攻擊的主要靶細(xì)胞[1-2]。CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的進(jìn)行性減少和CD4+T淋巴細(xì)胞功能的受損是免疫系統(tǒng)損害的重要表現(xiàn)，是HIV感染進(jìn)展的標(biāo)志[2]。

湘A-1號(hào)方（HNA-1,湖南省艾滋病防治小組推薦免費(fèi)使用的兩個(gè)中藥復(fù)方之一的提取物）是治療艾滋病的有效方劑。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)HNA-1具有促進(jìn)免疫重建的療效，且研究中未發(fā)現(xiàn)毒、副作用[3-4]；能改善模型小鼠的免疫缺陷、提高其CD4+T細(xì)胞數(shù)量[5]；能明顯提高猴免疫缺陷病毒SIV-mac239感染猴模型的CD4+T細(xì)胞數(shù)（尤其是初始型CD4+T細(xì)胞）、改善淋巴結(jié)組織結(jié)構(gòu)的病理退變，對(duì)猴免疫缺陷病毒感染導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)破壞具有一定的保護(hù)作用，同時(shí)有降低動(dòng)物死亡率的趨勢(shì)[6]。本研究進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)和T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)（T cell receptor excision cirles, TRECs）檢測的方法，探討HNA-1治療機(jī)制與初始型CD4+T細(xì)胞、胸腺輸出及胸腺細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系。

1材料

1.1動(dòng)物、藥物

1.1.1動(dòng)物恒河猴8頭，全部為雄性，體質(zhì)量4.75～7.2 Kg，5～7歲，外觀健康。經(jīng)血清學(xué)檢測猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒（SRV）、猴皰疹病毒（Herpes B virus）和猴T淋巴細(xì)胞I型病毒（STLV-I）抗體陰性，結(jié)核菌素陰性，痢疾菌陰性。動(dòng)物由廣東康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司繁育并提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物許可證證號(hào)為SCKX粵2009-0025，并參照美國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南》的相應(yīng)規(guī)范進(jìn)行管理[7]。實(shí)驗(yàn)獲湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.1.2藥物HNA-1組由白蔻仁6 g，茵陳15 g，石菖蒲10 g，黃芩10 g，連翹10 g，白花蛇舌草15 g，藿香10 g，虎杖15 g，滑石15 g，川木通6 g，薄荷6 g，薏苡仁30 g組成，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑教研室制備，薄荷提取揮發(fā)油用β環(huán)糊精包裹，其余藥物與提取后的薄荷水煎、醇沉，制備干膏粉。根據(jù)猴/人換算系數(shù)3.08估算臨床等效劑量[8]，得出干膏粉與β環(huán)糊精包含物的等效劑量分別為0.74 g/kg和5.74 mg/kg。配成水溶液混懸劑，使得每毫升混懸液含干膏粉0.185 g、β環(huán)糊精包含物1.44 mg（即5 kg猴灌胃20 mL）。

1.2試劑和儀器

1.2.1試劑DNA提取試劑盒（天跟有限公司）, CD34-PE、CD4-FITC, Dispase II (Roche，終濃度1 mg/mL), Collagenase IV (Invitrogen，終濃度1 mg/mL)和DNase I (Roche，終濃度0.5 mg/mL), SIVmac239毒種由美國P.A. Marx教授惠贈(zèng)。

1.2.2儀器流式儀（Beckman Coulter）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)；Premix Ex Taq Version2.0、RNAisoTMPlus、SYBR Premix-ExTaq (TaKaRa)；Real-time PCR探針（MBI公司）；C1 000 TM Thermal cycler熒光定量PCR儀。

2方法

2.1動(dòng)物分組感染

SIVmac239毒種5MID100（5個(gè)100％猴感染劑量），1 mL靜脈注射。經(jīng)用健康中國恒河猴外周血單核細(xì)胞體外擴(kuò)增2代的病毒液，用CEMx174細(xì)胞滴定，病毒滴定為105TCID50/mm3。感染時(shí)病毒液用雙蒸水1∶50稀釋，靜脈注入1 mL（即200TCID50）。本實(shí)驗(yàn)使用8頭恒河猴感染SIV，為期16～21個(gè)月。8頭恒河猴均為本課題其他實(shí)驗(yàn)的模型對(duì)照組，感染后未進(jìn)行過任何藥物干預(yù)，其中541為直腸感染，其余均使用靜脈感染。直腸感染方法為：動(dòng)物禁食40 h，經(jīng)氯胺酮麻醉后，取膝胸臥位，清潔直腸后，以2.5 mm兒科胃管從肛門插入約8 cm，注入1 mL 含104TCID50SIVmac239的病毒液；并保持該體位20 min。靜脈感染方法為經(jīng)頭靜脈注射1 mL含200 TCID50的病毒液感染。

2.2分組治療

根據(jù)CD4數(shù)量對(duì)8頭恒河猴分層后，隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，每組4只。治療組給予HNA-1灌胃治療，每日1次；對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃。兩組均給藥2個(gè)月。見表1。

表1　動(dòng)物感染情況及分組表

2.3 DNA的提取

在不同時(shí)間點(diǎn)收集對(duì)照組和治療組恒河猴外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取其DNA。DNA提取按照天跟試劑說明書操作。

2.4初始型CD4+T細(xì)胞的獲得

處死對(duì)照組和HNA-1組的恒河猴，取出胸腺。胸腺細(xì)胞的分離采用酶消化法，所用酶為Dispase II、Collagenase IV、和DNase I，37℃消化50 min。離心洗去消化液，提取純化的初始型CD4+T細(xì)胞。使用Real-time PCR進(jìn)行檢測，25 μL反應(yīng)體系包括：10 μL細(xì)胞裂解產(chǎn)物(2.5×104)，0.6μmol/L primers：（正向引物：5’-ATCACTCTGTGTCTAGCT CCCAGC-3’；反向引物：5’-ACTTGCTGAGTTTC ATGATGATT CCTCTA-3’）0.2 μmol/L Taqman探針；FAM-TGCG GG CTC CAT CCT CTC CTG T-TAMRA和ABI Master Mix。循環(huán)條件為：50℃，2 min; 95℃, 10 min; 40 cycles of 95℃, 15 s和60℃,1 min，40個(gè)循環(huán)。同時(shí)加入對(duì)ccr5基因檢測作為細(xì)胞數(shù)量均一化的內(nèi)參，擴(kuò)增引物為：正向引物：5’-TTC TCT GGA ATC TTC TTC ATC C-3；反向引物：5’- CAA AGG TGA CTG TCC TGG CTT T-3；Taqman探針為：VIC-AAC ACA GCA TGG ACG ATA GCC AGG TAC C-TAMRA。

2.5指標(biāo)檢測

2.5.1 TRECs的檢測參照Bains I的方法[10]，使用T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)（T cell receptor excision cirles, TRECs）檢測的方法，計(jì)算胸腺輸出細(xì)胞在初始CD4+T細(xì)胞中占的比例。

2.5.2 Ki-67的檢測取106-107待測單個(gè)胸腺細(xì)胞懸液，CD4分子染色洗滌后，每個(gè)流式管加入固定緩沖液100 μL，冰上避光孵育30 min，PBS液洗滌1遍，然后加入穿膜緩沖液300 μL，冰上避光孵育30 min，PBS液洗滌1遍，最后根據(jù)每管檢測目的加入Ki-67-APC1 μL，輕輕混勻，置于冰上避光孵育30 min，然后用PBS液洗滌2遍，1 200 r/min離心8 min，棄去上清，用手指彈勻細(xì)胞，保證流式管剩余150～200 μL單細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀檢測。

2.5.3 CD34+前體細(xì)胞的檢測分離的胸腺細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，1 200 r/min 10 min離心，棄掉上清液，加入適量鼠抗人CD14-FITC、CD3-FITC、CD20-FITC、CD34-PE熒光標(biāo)記抗體5 μL，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2遍，4％多聚甲醛固定、洗去固定液并PBS重懸后，F(xiàn)ACS檢測，計(jì)算CD34+Lin-細(xì)胞的比例。

2.5.4胸腺細(xì)胞發(fā)育階段的檢測根據(jù)已有的文獻(xiàn)[11]，使用鼠抗人CD45RA（CD45的一種亞型），CD3 (SP34.2)將胸腺細(xì)胞（及發(fā)育成熟的T細(xì)胞）分為CD45RA-CD3dim（II期）、CD45RA-CD3+（III期）和CD45RA+CD3+（IV期）。再進(jìn)一步用CD69，CD27分群進(jìn)行檢測分析。流式儀檢測并統(tǒng)計(jì)分析胸腺細(xì)胞不同發(fā)育階段的比例。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3結(jié)果

3.1 TRECs的比例改變

TRECs統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，對(duì)照組經(jīng)線性擬合后TRECs改變倍數(shù)明顯呈下降趨勢(shì)，其中3只動(dòng)物降至接近治療前的1/2。HNA-1治療組在經(jīng)過HNA-1治療后，TRECs改變倍數(shù)總體呈明顯的上升趨勢(shì)。經(jīng)重復(fù)測量分析，分析T值14.423，P<0.05顯示兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，由于TRECs的比例會(huì)隨著細(xì)胞分裂被逐漸稀釋；因此增殖細(xì)胞減少可導(dǎo)致TRECs比例相對(duì)升高。而本研究同時(shí)顯示CD4+T細(xì)胞表達(dá)Ki67+的比例并未增加，提示HNA-1治療組TRECs比例的增高為胸腺細(xì)胞輸出顯著增加。如圖1所示。

注：與對(duì)照組相比*P<0.05。圖1　HNA-1治療前、后TRECs（左）及Ki67（右）的改變

3.2胸腺CD34+Lin-細(xì)胞的比例

模型對(duì)照組和HNA-1組恒河猴胸腺內(nèi)的細(xì)胞經(jīng)流式檢測，分析比較發(fā)現(xiàn)，HNA-1組CD34+Lin-細(xì)胞明顯增加，提示SIV慢性感染后經(jīng)HNA-1治療，胸腺的前體細(xì)胞比例明顯增加，分析T值10.699，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

注：與對(duì)照組相比**P<0.01。圖2　HNA-1治療后胸腺CD34+Lin-細(xì)胞的比較柱形圖

3.3不同發(fā)育階段胸腺細(xì)胞的比例的改變

與模型對(duì)照組比較，HNA-1組雙陽性T細(xì)胞（Double positive，DP）Ⅱ階段的胸腺細(xì)胞比例減少，而DPⅢ和DPⅣ階段的細(xì)胞比例均增加。這些研究結(jié)果提示，HNA-1治療后可能促進(jìn)了胸腺細(xì)胞從DPⅡ階段發(fā)育至DPⅢ和DPⅣ階段。見圖3。

圖3　HNA-1治療后胸腺幼稚淋巴細(xì)胞不同發(fā)育階段改變的柱形圖

4討論

在前期研究中，發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方提取物HNA-1能有效增加外周血初始型CD4+T細(xì)胞的比例；但CD4+T細(xì)胞來源于骨髓還是胸腺并不清楚。在本研究中，首先使用TRECs檢測的方法對(duì)胸腺輸出功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。TRECs在TCR重排的過程中產(chǎn)生，并在外周組織中的T細(xì)胞中穩(wěn)定存在；它不參與細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制，并隨著細(xì)胞分裂被逐代稀釋。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)HNA-1治療SIV感染恒河猴后，外周血TRECs的比例明顯增加，且隨著HNA-1治療的周數(shù)增加而更為顯著；同時(shí)細(xì)胞增殖并未明顯降低。這提示HNA-1能提升胸腺輸出功能。

在AIDS發(fā)病和免疫重建的過程中，胸腺輸出初始型CD4+T細(xì)胞起到了重要作用。在感染的前3個(gè)月左右[12-13]，以及感染后期[14]，胸腺輸出初始型CD4+T細(xì)胞對(duì)于維持外周CD4+T細(xì)胞庫的穩(wěn)態(tài)起著主要作用。在高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療法(highly active antiretroviral therapy, HAART)治療晚期感染的患者，即使病毒載量被控制在低于檢測水平，也常常由于初始型CD4+T細(xì)胞無法恢復(fù)而免疫重建失敗。因此，我們發(fā)現(xiàn)HNA-1促進(jìn)胸腺輸出、提高外周血初始型CD4+T細(xì)胞比例，可能有重要的臨床價(jià)值。

然而，如果HNA-1僅僅只是將未發(fā)育成熟的初始型CD4+T細(xì)胞動(dòng)員至外周，有可能一時(shí)取得療效，而無法取得持續(xù)的療效。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)胸腺細(xì)胞發(fā)育的情況進(jìn)行了分析。我們發(fā)現(xiàn)，HNA-1治療后胸腺CD34+Lin-細(xì)胞的比例顯著增加，這表明HNA-1治療能提高骨髓的前體細(xì)胞進(jìn)入胸腺。此外，我們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HNA-1治療促進(jìn)了胸腺細(xì)胞從DPⅡ階段發(fā)育至DPⅢ和DPⅣ階段。這就表明，HNA-1不僅僅只是將胸腺細(xì)胞動(dòng)員至外周，而是提高前體細(xì)胞比例、促進(jìn)胸腺細(xì)胞分化，是有可能實(shí)現(xiàn)持久的療效的。然而，這還需要更進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果證明。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，HNA-1治療SIV感染的恒河猴后，通過提高胸腺輸出初始型CD4+T細(xì)胞，從而起到維持CD4+T細(xì)胞數(shù)量、促進(jìn)免疫重建的作用；且其機(jī)制與增高胸腺CD34+細(xì)胞的比例、以及促進(jìn)CD4+T細(xì)胞發(fā)育密切相關(guān)。

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（本文編輯楊瑛）

Effects of HNA-1 Extracted from a Chinese Medicine Compound on the Thymic Output and Thymocyte Development in Rhesus Macaques with SIV Chronic Infection

WANG Xiaomei1, CHEN Song2, CHEN Yingyu2, HU Yan1, ZHANG Xiaoyu3, NING Xingwang1, ZHU Huibin*
(1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410007, China; 2. The Research Institute of Tropical Medicine of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong 510403, China; 3. Department of Surgery, the second People's Hospital of Hunan Province, Changsha, Hunan 410007, China)

Abstract〔〕Objective To investigate the effect of Chinese herbal extract HNA-1 on HIV -1 infection and AIDS. Methods Eight Chinese rhesus macaques had been infected by SIVmac239 for 16 to 21 months were enrolled into this study, the treatment group received HNA -1, control group received normal saline for consecutively 2 months, respectively. In predesigned time-points, peripheral blood were drawn for DNA extraction, and thereby thymic output was evaluated by T-cell receptor excision circle (TRECs) quantification. The thymocyte cells were seperated by enzyme digestion, the proportions of CD34+cells and thymocytes in various development stages were analyzed by flow cytometry. Results Compared with control group, the thymic output function obviously was elevated in HNA-1 group (P<0.05). And the proportion of CD34+Lin-book=7,ebook=10cells was significantly increased (P <0.05). More interestingly, the thymocytes in double positive (DP) stage Ⅱdecreased dramatically, while thymocytes in stage DPⅢand stage DPⅣincreased. Conclusion Enhanced thymic output function may contribute to the effect of HNA-1 on AIDS treatment with underlying mechanisms involving increased thymic progenitor cells and promoted development of thymocytes from stage DPⅡto stage DPⅢ.

Keywords〔〕HNA-1; CD4+T cells; thymic output; thymocyte development

〔通訊作者〕*朱惠斌，女，教授，主任技師，E-mail：1587370309@qq.com。

〔作者簡介〕王小妹，女，檢驗(yàn)師，主要從事中藥新藥的研究與開發(fā)。

〔基金項(xiàng)目〕國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81274169)；湖南省高等學(xué)校科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(12A102)；湖南省教育廳項(xiàng)目（13C688）；湖南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)“感染性疾病中醫(yī)藥防治研究”資助項(xiàng)目(NO:15)。

〔收稿日期〕2015-11-03

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.002