張　芳,劉建榮*,馬月宏,丁彩云,尹海珍,高嵩丹

（山西省人民醫(yī)院，山西太原030012）

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精液中SCF/c-kit值在腎虛男性不育辨證中的價(jià)值

張芳,劉建榮*,馬月宏,丁彩云,尹海珍,高嵩丹

（山西省人民醫(yī)院，山西太原030012）

〔摘要〕目的評價(jià)精液中干細(xì)胞因子（stem cell factor, SCF）及其受體（c-kit）在男性不育腎虛證中的臨床診斷價(jià)值，為腎藏精主生殖的基本理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法選取45例腎虛不育型患者與30例正常生育者進(jìn)行對照研究，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法）測定兩組精漿中SCF含量，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對精液離心沉淀物檢測c-kit的ct值，并計(jì)算其相對表達(dá)量。結(jié)果兩組患者SCF濃度比較無差異（P>0.05），與正常生育組比較，腎虛不育患者前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)明顯降低（P< 0.01）、精液離心沉淀物c-kit相對表達(dá)量升高（P<0.05）。結(jié)論男性不育腎虛證與精子活動(dòng)和精液中c-kit表達(dá)量密切相關(guān)，兩者可以作為男性不育腎虛證辨證時(shí)重要的客觀指標(biāo)，同時(shí)為中醫(yī)腎藏精主生殖理論提供科學(xué)依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕男性不育；腎虛證；干細(xì)胞因子；原癌基因蛋白質(zhì)；弱精；精液

男性不育癥指的是夫妻同居一年以上，沒有采取任何避孕措施，因?yàn)槟蟹揭蛩匾鹋讲辉小＝陙?，男性不育呈明顯增高的趨勢。中醫(yī)診療男性不育積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，但中醫(yī)診斷男性不育需要辨證分型，臨床的客觀指標(biāo)很少。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎藏精、主生殖”，精液是男性生殖的主要物質(zhì)。新近認(rèn)識(shí)的干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）及其受體——原癌基因蛋白質(zhì)（c-kit）具有調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞增殖、分化、減數(shù)分裂和細(xì)胞凋亡的作用[1]。因此，研究組擬從精液中研究SCF/c-kit與男性不育腎虛證的關(guān)系，從而揭示中醫(yī)基礎(chǔ)理論腎藏精、主生殖的分子基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料采集2013年1月-2014年6月山西省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)門診腎虛不育患者45例、年齡（25～35）歲，平均（29.3±3.8）歲，30例正常生育者作為對照，年齡（25～35）歲，平均（28.9±3.9）歲，兩組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn)研究分為兩組：腎虛不育組、正常生育組。同時(shí)符合以下診斷的納入腎虛不育組：（1）男性不育癥診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO《人類精液及精子宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊》[2]：夫妻有1年或1年以上正常性生活，在未采取避孕措施的情況下，妻子未懷孕，并且排除女方因素，診斷為男性不育癥。（2）腎虛診斷參照《王琦男科學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)[3]：①腎精氣不足型，證候表現(xiàn)為頭昏耳鳴，腰膝酸軟，記憶力減退，神疲乏力，舌淡苔白，脈沉細(xì)尺弱，精子稀少；②腎陰虛衰型，證候表現(xiàn)為潮熱盜汗，五心煩熱，口干咽燥，頭昏耳鳴，腰膝酸軟，性欲減退或遺精，大便秘結(jié)，舌嫩紅，脈細(xì)數(shù)而尺弱；③腎陽不足型，證候表現(xiàn)為精神萎鈍，神疲乏力，腰膝酸軟，畏寒肢冷，性欲減退或陽痿早泄，小便清長夜多，大便稀溏。舌淡胖嫩，脈遲而尺弱。

正常生育組同時(shí)符合以下①-⑤條件：①正常生育男性，且在一年內(nèi)有生育；②沒有任何癥狀，中醫(yī)診斷未能確定任何證型；③年齡控制在25～35歲；④男性外生殖器檢查正常，無明顯異常；⑤精液檢查結(jié)果未見異常。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn)（1）逆行射精或不射精患者；睪丸體積小于10 mL患者；（2）精液中有白細(xì)胞或細(xì)菌培養(yǎng)陽性，或沙眼衣原體、解脲支原體、人型支原體陽性患者；（3）內(nèi)分泌檢測性腺功能異常及染色體核型異常者；（4）從事放射等特殊職業(yè)者；（5）服抗癲癇、抗腫瘤等有礙生精及精子活力的藥物者；（6）有其他性傳播疾病的患者；（7）合并嚴(yán)重心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等其他疾病，精神病患者。

1.2主要試劑與儀器

Trizol(Invitrogen，美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Takara公司），人SCF免疫試劑盒(Boster公司)，SynergyH4多功能讀數(shù)儀(美國伯騰)，CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國伯樂)，-80℃冰箱，37℃水浴恒溫箱，BioSpectrometer紫外/可見光分光光度計(jì)（Eppendorf），低速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5430R），T100梯度PCR儀（美國伯樂），WLJY9000精子分析儀（北京偉力公司）。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集精液采集時(shí)，要求患者禁欲3～ 7 d，均以手淫法進(jìn)行精液采集，收集于無毒、無菌的塑料容器中，取50 μL進(jìn)行精液分析，剩余精液離心3 000 r/min，分離精漿和精液沉淀物，于-80℃冰箱保存待測。

1.3.2精液分析將采集的精液置于37℃水浴恒溫箱中，測定精液體積，待精液樣本充分液化之后，進(jìn)行精子活力檢測。

1.3.3精漿SCF濃度檢測標(biāo)本統(tǒng)一復(fù)融，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測各組精漿SCF濃度，采用SynergyH4多功能讀數(shù)儀測定，操作嚴(yán)格按照說明書。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR Trizol試劑抽提精漿沉淀總RNA，紫外/可見光分光光度計(jì)測定RNA純度和濃度，經(jīng)純度鑒定和濃度測定后，取500 ng總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書行逆轉(zhuǎn)錄，取1.0 μL 的cDNA作為模板，采用熒光定量PCR儀，按熒光定量檢測試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，βactin為內(nèi)參。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，c-kit上游引物：5'-tcctcgcctccaagaattgt-3'，下游引物：5'-tcacaggtagtcgagcgttt-3'，擴(kuò)增片段長度為156 bp，β-actin的上游引物：5'-cacccgcgagtacaaccttc-3'，下游引物：5'-cccatacccaccatcacacc-3'，擴(kuò)增片段長度為207 bp。用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)參數(shù)：95℃變性30 s，之后95℃變性5 s，60℃退火加延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。目的基因的相對表達(dá)量為2-葒葒ct。

1.3.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1精液分析和SCF結(jié)果比較

精液檢查結(jié)果顯示，腎虛不育組前向運(yùn)動(dòng)精子(A+B）明顯低于正常生育組（P<0.01），兩組在精液量、精子密度、SCF濃度上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1　兩組精液分析和SCF濃度比較（±s）

表1　兩組精液分析和SCF濃度比較（±s）

注：與正常生育組比較**P<0.01。

組別　n　　精液量(mL)　　密度(×106/mL)　　前向運(yùn)動(dòng)精子(A+B)(％)　SCF(pg/mL)正常生育組　30　2.72±0.79　44.26±17.32　51.24±10.36　96.33±28.45腎虛不育組　45　2.42±0.85　31.48±21.41　21.83±15.25**　77.54±47.22 t 1.635　5.656　0.982 p 0.055　0.000　0.177

2.2精液沉淀物c-kit結(jié)果比較

腎虛不育組c-kit表達(dá)高于正常生育組（P< 0.05)，結(jié)果見表2。

表2　兩組精液沉淀物c-kit表達(dá)?。ā纒）

表2　兩組精液沉淀物c-kit表達(dá)?。ā纒）

注：與正常生育組比較*P<0.05。

組別　n　c-kit正常生育組　30　1.07±0.93腎虛不育組　45　2.39±1.37* t 2.389 p 0.011

3討論

SCF/c-kit在男性生殖中起著重要作用。精子的發(fā)生在性腺軸的控制之下，F(xiàn)SH作用于支持細(xì)胞，支持細(xì)胞分泌SCF，SCF與生精細(xì)胞上的受體c-kit結(jié)合，調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的自我更新和增殖，從而導(dǎo)致精子發(fā)生[4-5]。SCF由支持細(xì)胞分泌，隨著生育能力的逐漸旺盛，睪丸組織中的SCF表達(dá)也在逐漸增多，表明生精功能的增強(qiáng)與SCF表達(dá)增多有密切關(guān)系，SCF受體即c-kit蛋白是由原癌基因c-kit表達(dá)的蛋白質(zhì)，在各級生精細(xì)胞，睪丸中c-kit mRNA至少有兩種形式[6]，c-kit在生精細(xì)胞的表達(dá)與精子發(fā)生密切相關(guān)[7]。SCF與其受體c-kit相互作用調(diào)節(jié)生精細(xì)胞增殖、分化、減數(shù)分裂和細(xì)胞凋亡，SCF/c-kit系統(tǒng)可通過不同途徑調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的自我更新和增殖，通過磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）通路使c-kit陽性精原細(xì)胞從G1期向S期過渡，還通過激活分裂激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）通路控制生精過程的進(jìn)程[8]。SCF/c-kit在抗細(xì)胞凋亡方面也發(fā)揮重要作用，SCF通過激活c-kit受體以維持細(xì)胞增殖和凋亡的平衡，從而調(diào)節(jié)著生精細(xì)胞的生存與凋亡[9]。

男性不育癥病變關(guān)鍵在腎，益腎補(bǔ)精是治療本病的重要原則[10]，因此我們擬從精液SCF/c-kit研究其在腎虛辨證中的變化情況。該研究中通過病史詢問和精液檢查，首先按照男性不育癥的標(biāo)準(zhǔn)，確定了診斷，對于診斷為不育的患者再按照腎虛的標(biāo)準(zhǔn)確定腎虛不育患者，這些患者部分表現(xiàn)為弱精癥，部分表現(xiàn)為少精癥，部分兩者皆有。研究結(jié)果表明兩組患者比較精子密度沒有差異（P>0.05），精漿SCF表達(dá)兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）、前向運(yùn)動(dòng)精子腎虛不育組明顯低于正常生育組（P<0.01）、精液沉淀物中c-kit表達(dá)腎虛不育組高于正常生育組（P< 0.05）。從該結(jié)果可以看出，精子密度和SCF兩組比較沒有差異，說明此兩指標(biāo)與腎虛辨證無關(guān)，SCF是由支持細(xì)胞分泌，腎虛時(shí)可能支持細(xì)胞沒有受損，因此SCF表達(dá)沒有變化。腎虛者前向運(yùn)動(dòng)精子降低、精液沉淀物中c-kit表達(dá)升高，c-kit主要表達(dá)于原始的生精細(xì)胞，腎虛者睪丸受損，生精細(xì)胞脫落較多從而導(dǎo)致精液沉淀物中c-kit升高。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎藏精、主生殖，腎虛與不育密切相關(guān)。腎藏之精包括先天之精和后天之精，內(nèi)寓元陰元陽。腎氣以腎精為物質(zhì)基礎(chǔ)，腎氣充足才能有子。正如《素問·上古天真論》所說：“丈夫八歲，腎氣實(shí)……二八腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽和，故能有子……七八，……天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極”?？梢姡I氣充足才有子，腎氣衰敗則無子。精液是男性生殖的最終產(chǎn)物，因此可以通過精液了解腎氣的盛衰。該研究通過精液檢查，同時(shí)在精液中檢測了生精過程中的重要物質(zhì)SCF/c-kit，結(jié)果表明，弱精和c-kit升高與腎虛不育密切相關(guān)，在臨床辨證時(shí)除了癥狀外，還可以參考精液中精子活動(dòng)、c-kit這兩個(gè)重要指標(biāo)，從而為提高中醫(yī)辨證的準(zhǔn)確性提供客觀指標(biāo)，為中醫(yī)腎藏精主生殖的基本理論提供科學(xué)依據(jù)。

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（本文編輯賀慧娥）

·中藥分析·

The Value of SCF/c-kit in Semen of Infertile Male with Nephrasthenia Syndrome

ZHANG Fang, LIU Jianrong*, MA Yuehong, DING Caiyun, YIN Haizhen, GAO Songdan
（The People's Hospital of Shanxi, Taiyuan, Shanxi 030012，China）

Abstract〔〕Objective To evaluate the value of SCF/c-kit in the diagnosis for male infertility with kidney deficiency, and to provide experimental references of the theory to the kidney stores the essence and controls reproductivity. Methods 45 infertile males with kidney deficiency were selected and 30 fertile men were used as control. SCF in seminal plasma was determined by ELISA. The relative expression of c-Kit was detected by real-time PCR, and the relative expression quantity was caculated. Results There is no difference of SCF concentration between the two groups (P>0.05). Compared with fertile men, the forward movement of sperm in infertile men with kidney deficiency was decreased obviously (P<0.01), and relative expression of c -kit was significantly increased (P <0.05). Conclusion Kidney deficiency is closely related to sperm motility and the relative expression quantity of c-Kit in sperm., which can be as indicators for infertile male with kidney deficiency. This study provides scientific basis for the theory of kidney storing the essence and controlling reproductivity.

Keywords〔〕male infertility; nephrasthenia syndrome; stem cell factor; c-kit; asthenospermia; semen

〔通訊作者〕*劉建榮，男，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：liujianrong3@sina.com。

〔作者簡介〕張芳，女，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主要從事生殖疾病的研究。

〔基金項(xiàng)目〕山西省衛(wèi)生廳科研課題(201201061)。

〔收稿日期〕2015-12-01

〔中圖分類號(hào)〕R256.56

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.006