顧建明，蔣盼（上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海市能源作物育種及應(yīng)用重點實驗室，上海200444）

?

干豆制品用大豆中大豆異黃酮提取工藝研究

顧建明，蔣盼
（上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海市能源作物育種及應(yīng)用重點實驗室，上海200444）

摘要：以干豆制品加工用大豆為原料，研究了浸提溫度、浸提時間、超聲波處理時間和大豆壓制厚度對大豆中大豆異黃酮和大豆蛋白浸出效果的影響，經(jīng)過正交試驗和結(jié)果分析得到大豆異黃酮浸出的最佳處理組合為超聲波處理時間40min，壓制厚度10%，浸提溫度55℃，浸提時間12h，以此每噸大豆可回收大豆異黃酮790.67g。

關(guān)鍵詞：大豆；大豆異黃酮；回收；食品

在我國大豆制品加工具有悠久的歷史，大小加工廠遍布城鄉(xiāng)各地，其中每年用于老豆腐、豆腐干、百葉、素雞等干豆制品加工的大豆數(shù)量十分巨大。在這些干豆制品生產(chǎn)過程中，點鹵后的壓濾會產(chǎn)生大量的廢水，廢水的排放對環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，這些廢水中含有豐富的大豆可溶性保健功能物質(zhì)，如大豆異黃酮（soybean isoflavone），研究顯示，由此造成的大豆異黃酮的損失約占大豆異黃酮總量的44 %[1-2]。

大豆異黃酮具有類雌激素活性，能緩解婦女更年期綜合癥狀且安全性高[3]，抗氧化性[4-5]，抗癌活性[6-7]，以及預(yù)防骨質(zhì)疏松[8]、緩解糖尿病癥狀[9-10]和預(yù)防心血管疾病[11-12]的作用。

異黃酮在自然界中的資源十分有限，僅分布于豆科的蝶形亞科的極少數(shù)植物中，大豆是唯一含異黃酮且其含量具有人體保健功能意義的食物資源[13]。大豆異黃酮有四類12種存在形式：異黃酮甙元（大豆黃素daidzein、黃豆黃素glycitein、染料木素genistein），β-葡萄糖甙（daidzin、glycitin、genistin），6"-O-乙?；咸烟沁昂?"-O-丙二?；咸烟沁?。

目前市場上銷售的大豆異黃酮從脫脂大豆粕中提取制得，從干豆制品加工用大豆中采用本論文的預(yù)處理方法回收大豆異黃酮的研究鮮見報道[14-19]。與從干豆制品加工過程中壓濾出的黃漿水中回收大豆異黃酮相比較，本論文旨在進(jìn)一步尋求一種高效、經(jīng)濟(jì)、高品質(zhì)和適合工業(yè)化生產(chǎn)的回收大豆異黃酮的方法。

1　材料和方法

1.1材料

考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白質(zhì)、甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），磷酸（分析純，≥85 %），BHT（色譜純，純度≥99 %）；大豆異黃酮（Daidzein，Glycitein，Genistein，純度≥99 %）購自同田生化技術(shù)有限公司；大豆購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2儀器

恒溫干燥箱（DHG-9240A）：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS24型）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KQ-100超聲儀（40KHZ/100W）：上海施蘭自動化設(shè)備有限公司；低速離心機(jī)（YXJ-1型）：江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；電子分析天平（AB104）：METTL ER-TOLEDO Group，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高效液相色譜儀（LC-20A）：日本島津，SPD-20A紫外檢測器、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT泵。

1.3方法

1.3.1大豆異黃酮的測定

1.3.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

準(zhǔn)確稱取大豆黃素、黃豆黃素、染料木素標(biāo)準(zhǔn)樣品各5 mg，甲醇溶解后定容于50 mL容量瓶中，配置成3種大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)品母液（0.1 mg/mL），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在紫外區(qū)（199 nm～400 nm）掃描確定其最大吸收波長[20]。

準(zhǔn)確吸取大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品母液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，制得1、2、4、6、8、10 μg/mL的3種大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用Ф13 mm，孔徑為0.45 μm的有機(jī)針孔過濾器過濾于進(jìn)樣瓶中，色譜柱CLC-NH2（Ф6 mm×150 mm），流動相：V乙腈∶V0.001 %磷酸= 28∶72，流速0.7 mL/min，柱溫40℃，最大吸收波長下檢測，進(jìn)樣10 μL，重復(fù)測定3次，繪制大豆黃素、黃豆黃素、染料木素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（μg/mL）與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.2處理樣品測定

每個處理均取大豆15 g，加入100 mL水，處理完成后，濾紙過濾，得澄清浸出液，定容至50 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取20 mL浸出液，加入25 mL甲醇，50 mL鹽酸溶液（4 mol/L），0.75 g BHT，水浴（44.6℃）回流3 h后過濾，收集上清液，用甲醇定容至100 mL，4℃下保存。吸取該處理液500 μL，用Ф13 mm，孔徑為0.45 μm的有機(jī)針孔過濾器過濾于進(jìn)樣器中，在相同色譜條件下測定樣品的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中大豆異黃酮的濃度/含量。單因素試驗中采用計算定容至50 mL的濃度（μg/mL），正交試驗中采用計算15 g大豆中的大豆異黃酮含量（mg）。

1.3.2大豆可溶性蛋白的測定

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

采用考馬斯亮藍(lán)染料比色法測定，計算蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）與吸光度（A）的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.3.2.2處理樣品測定

每個處理均從上述備用澄清浸出液中吸取1 mL，定容至100 mL，再從中吸取1.0 mL稀釋液與5.0 mL考馬斯亮藍(lán)充分混合，2 min后測定吸光度A（λ=595 nm），按蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算可溶性大豆蛋白質(zhì)濃度，單因素和正交試驗中采用的蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）/含量（mg）計算方法同上。

1.3.3干豆制品用大豆中大豆異黃酮的浸出

1.3.3.1浸提時間對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響

將大豆壓制成原厚度的50 %，浸沒于100 mL水中，在25℃下分別放置2、6、12、18、20 h，過濾，分別收集各時間的浸出液，測定浸出液中大豆異黃酮和大豆蛋白的濃度。繪制浸提時間（h）和大豆異黃酮濃度/大豆蛋白濃度（μg/mL）關(guān)系的曲線。

1.3.3.2浸提溫度對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響

將大豆壓制成原厚度的50 %，浸沒于100 mL水中，在2、25、35、45、55、65、75℃下分別放置12 h，過濾，分別收集各溫度下的浸出液，測定浸出液中大豆異黃酮和大豆蛋白的濃度。繪制浸提溫度（℃）和大豆異黃酮濃度/大豆蛋白濃度（μg/mL）關(guān)系的曲線。

1.3.3.3壓制厚度對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響

將大豆分別壓制成原厚度的10 %、50 %、100 %，浸沒于100 mL水中，在25℃下分別放置18 h，過濾，分別收集各厚度下的浸出液，測定浸出液中大豆異黃酮和大豆蛋白的濃度，繪制壓制厚度（%）和大豆異黃酮濃度/大豆蛋白濃度（μg/mL）關(guān)系的曲線。

1.3.3.4超聲波處理時間對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響

將大豆壓制成原厚度的50 %，浸沒于100 mL水中，在室溫下超聲波（40 kHz，100 W）分別處理10、20、30、40、50、60 min，過濾，分別收集各處理浸提液，測定浸提液中大豆異黃酮和大豆蛋白的濃度，繪制超聲波處理時間（min）和大豆異黃酮濃度/大豆蛋白濃度（μg/mL）關(guān)系的曲線。

1.3.3.5大豆異黃酮的最佳浸出條件

大豆異黃酮的最佳浸出條件采用正交試驗L9（34）來確定。選取浸出時間（h）、浸出溫度（℃）、壓制厚度（%）、超聲波處理時間（min）四個因素三水平進(jìn)行試驗（見表1）。浸出液經(jīng)過濾后，測定每個處理大豆浸出液中的大豆異黃酮和大豆蛋白含量（mg/15 g大豆），在相對有較高的大豆異黃酮浸出的前提下，盡可能兼顧有較少的大豆蛋白浸出，以此評價每個處理并得出最佳大豆異黃酮的浸出條件。

表1　浸出正交試驗的因素和水平表L9（34）Table 1 The factors and levels of orthogonal design for soybean leaching，L9（34）

2　結(jié)果和討論

2.1大豆異黃酮測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

大豆黃素、黃豆黃素、染料木素的最大吸收波長分別為248、258、260 nm。

3種大豆異黃酮（大豆黃素、黃豆黃素、染料木素）濃度與峰面積方程分別為y=104 835x+4 119.7，R2= 0.990 9；y = 97 218x - 74 013，R2= 0.991 1；y = 53 807x+ 3 914.3，R2=0.990 7，在1 μg/mL～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈較好的線性關(guān)系。

2.2大豆蛋白測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

蛋白質(zhì)濃度與吸光度方程為y=0.007 5x+0.043 8，R2=0.991 6。在波長595 nm處，在10 μg/mL～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與吸光度呈較好的線性關(guān)系。

2.3浸提時間對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響

浸提時間對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響見圖1。

圖1　浸提時間對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響Fig.1 The effect of soaking time on soybean isoflavones and protein leaching

圖1顯示，隨著浸提時間的延長，3種大豆異黃酮的含量逐漸增加，當(dāng)達(dá)到18 h時，3種大豆異黃酮的含量達(dá)到最大值，其中大豆黃素的含量為29.05 μg/mL，黃豆黃素的含量為40.69 μg/mL，染料木素的含量為25.42 μg/mL，但是當(dāng)浸提時間延長至20h時，3種異黃酮的含量開始下降。同樣，浸提開始后，可溶性蛋白的含量不斷增加，在18 h達(dá)到最大值888.25 μg/mL，18 h后蛋白含量開始下降。這可能與浸提液的微生物腐敗有關(guān)。因此，5 h～18 h為可選擇的浸提時間范圍。

2.4浸提溫度對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響

浸提溫度對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響見圖2。

圖2　浸提溫度對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響Fig.2 The effect of soaking temperature on soybean isoflavones and protein leaching

圖2顯示，隨著浸提溫度的提高，12 h后，浸提液中3種大豆異黃酮的含量也呈增加趨勢，55℃時達(dá)到最大值，其中大豆黃素的含量為70.82μg/mL，黃豆黃素的含量為101.88 μg/mL，染料木素的含量為62.53 μg/mL，再提高浸提溫度，則3種大豆異黃酮的含量呈下降趨勢。同樣浸提開始后蛋白含量呈增加趨勢，45℃達(dá)到最大值1281.50μg/mL，繼續(xù)提高浸提溫度，則蛋白含量呈下降趨勢。因此，35℃～55℃為可選擇的浸提溫度范圍。

2.5大豆厚度對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響

大豆厚度對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響見圖3。

圖3顯示，隨著大豆厚度的減小，浸出液中3種異黃酮含量逐漸增加，其中，與50 %厚度相比，10 %厚度的浸提液中，黃豆黃素的含量增加了17.5 %，大豆黃素的含量增加了12.3 %，而染料木素增加卻并不明顯。大豆蛋白含量也隨著大豆厚度的減小而增加，但是，50 %與10 %厚度的含量接近。

圖3　大豆厚度對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響Fig.3 The effect of flake thickness on soybean isoflavones and protein leaching

2.6超聲波處理時間對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響

超聲波處理時間對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響見圖4。

圖4　超聲波處理時間對大豆異黃酮和大豆蛋白浸出的影響Fig.4 The effect of ultrasonic time on soybean isoflavones and protein leaching

圖4顯示，隨著超聲波處理時間的延長，浸提液中大豆異黃酮的含量總體上呈增加趨勢，30 min之后，浸提液中大豆蛋白的含量并無顯著增加，50 min時，大豆變熟，不利于后續(xù)豆制品的制作。因此，20 min～40 min可作為超聲波處理選取時間范圍。

2.7大豆異黃酮的最佳浸出條件

大豆異黃酮和大豆蛋白浸出正交試驗見表2。

從表2可得出大豆異黃酮的最佳浸出條件為大豆黃素A3B3C3D2，影響因素順序為厚度（B）>溫度（C）>超聲時間（A）>浸泡時間（D）；黃豆黃素A3B3C3D2，影響因素順序為厚度（B）>溫度（C）>超聲時間（A）>浸泡時間（D）；染料木素A3B3C3D2，影響因素順序為厚度（B）>溫度（C）>超聲時間（A）>浸泡時間（D）?？扇苄缘鞍捉隽孔钌俚淖罴呀鰲l件為A3B1C2D1，影響因素順序為厚度（B）>溫度（C）>浸泡時間（D）>超聲時間（A）。

總大豆異黃酮最佳浸出條件為A3B3C3D2，即超聲時間40 min，厚度10 %，溫度55℃，浸泡時間12 h，影響因素順序為厚度（B）>溫度（C）>超聲時間（A）>浸泡時間（D）。采用Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行分析，在該條件下預(yù)測值為11.86 mg/15 g，為驗證該結(jié)果的可靠性，在此參數(shù)條件下，進(jìn)行5組驗證試驗，實際測得浸出的總大豆異黃酮（大豆蛋白）為12.01（65.04）、9.98 （44.25）、11.35（57.52）、10.21（56.90）、10.92（59.17）mg/15 g，平均值為10.89（56.58）mg/15 g，與預(yù)測值偏差僅為-8.2 %，在一般食品分析允許的相對誤差范圍內(nèi)（含量＜1 %，允許相對誤差＞5 %），故此預(yù)測值可信。按此預(yù)處理條件每噸大豆可回收大豆異黃酮790.67 g，大豆蛋白的浸出量在可以接受的范圍內(nèi)，該大豆蛋白采用豆制品加工用凝固劑沉淀后，可回收繼續(xù)用于后續(xù)干豆制品的生產(chǎn)。

3　結(jié)論

通過對干豆制品加工用大豆進(jìn)行預(yù)處理（前處理法），最大限度地回收大豆異黃酮，減少在加工過程中因壓濾而帶來的損失，該方法較從大豆蛋白經(jīng)凝固和壓濾產(chǎn)生的黃漿水中回收大豆異黃酮（后處理法）最大的優(yōu)點在于提取液水量可控，無大豆蛋白凝固劑殘留（如CaSO4、MgCl2），回收成本低，成品質(zhì)量高，工業(yè)化回收生產(chǎn)可行，浸出液可直接用于食品的加工生產(chǎn)。這項技術(shù)的研究成果對充分利用大豆食品資源、減少環(huán)境污染和降低廢水處理成本、提高豆制品生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益都具有重要的參考價值。

參考文獻(xiàn)：

[1] Umphress Sabrina T,Murphy Suzanne P,Franke Adrian A,et al. Isoflavone content of foods with soy additives[J]. Journal of food composition and analysis,2005,18(6):533-550

[2] Wang H J, Murphy P A. Isoflavone content in commercial soybean foods[J]. Journal of agricultural and food chemistry, 1994, 42(8): 1666-1673

[3] Levis Silvina,Strickman-Stein Nancy,Doerge Daniel R,et al. Design and baseline characteristics of the soy phytoestrogens as replacement estrogen (SPARE) study-A clinical trial of the effects of soy isoflavones in menopausal women[J]. Contemporary clinical trials, 2010, 31(4):293-302

[4] Gyorgy P,Murata K,Ikehata H. Antioxidants isolated from fermented soybeans[J]. Nature,1964,203:870-872

[5] Zih-Rou Huang,Chi-Feng Hung,Yin-Ku Lin,et al. In vitro and in vivo evaluation of topical delivery and potential dermal use of soy isoflavones genistein and daidzein[J]. International journal of pharmaceutics,2008,364(1):36-44

[6] Mizunuma H,Kanazawa K,Ogura S,et al. Anticarcinogenic effects of isoflavones may be mediated by genistein in mouse mammary tumor virus-induced breast cancer[J]. Oncology,2002,62(1):78-84

[7] Wada K,Nakamura K,Tamai Y,et al. Soy isoflavone intake and breast cancer risk in Japan: from the Takayama study[J]. International journal of cancer,2013,133(4): 952-960

[8] Gilberto Eiji Shiguemoto,Elizeu Antonio Rossi,Vilmar Baldissera,et al. Isoflavone-supplemented soy yoghurt associated with resistive physical exercise increase bone mineral density of ovariectomized rats[J]. Maturitas,2007,57(3):261-270

[9] Lee C H,Lin Y,Jin Ze X,et al. Relative antioxidant activity of soybean isoflavones and their glycosides[J]. Food chemistry,2005,90(4): 735-741

[10] Lund T D,Fleming D E,Dayton J R,et al. Dietary soy phytoestrogens effects on retinal thickness in rats[J]. Nutritional neuroscience,2003, 6(1):47-51

[11] Eliana A P Nahas,Jorge Nahas-Neto,Fabio L Orsatti,et al. Efficacy and safety of a soy isoflavone extract in post-menopausal women: A randomized, double-blind, and placebo-controlled study[J]. Maturitas,2007,58(3):249-258

[12] Nathan Gray. Review backs blood pressure benefits of soy isoflavone [J]. Nutrition, metabolism and cardiovascular diseases,2011,23(2): 34-37

[13]孫君明,丁安林.地理環(huán)境對大豆種子中異黃酮含量積累的影響趨勢[J].大豆科學(xué),1998,17(4):305-310

[14] Yoshiara L Y,Madeira T B,Delaroza F,et al. Optimization of soy isoflavone extraction with different solvents using the simplex-centroid mixture design[J]. International journal of food sciences and nutrition,2012,63(8):978-986

[15] Niamnuy C,Nachaisin M,Poomsa-ad N,et al. Kinetic modelling of drying and conversation/degradation of isoflavones during infrared drying of soybean[J]. Food chemistry, 2012,133(3):946-952

[16] Goes -Favoni S P,Carrao -Panizzi M C, Beleia A. Changes of isoflavone in soybean cotyledons soaked in different volumes of water[J]. Food chemistry,2010,119(4):1605-1612

[17] Jankowiak L,Trifunovic O,Boom R M,et al. J. The potential of crude okara for isoflavone production[J]. Journal of food engineering, 2014, 124:166-172

[18] Lima F S, Ida E I. Optimisation of soybean hydrothermal treatment for the conversion of β-glucoside isoflavones to aglycones[J]. LWT-food science and technology,2014,56(2):232-239

[19] Fernando Sanches de Lima,Louise Emy Kurozawa,Elza Iouko Ida. The effects of soybean soaking on grain properties and isoflavones loss[J].LWT-foodscienceandtechnology,2014,59(2):1274-1282

[20] Mauricio A,Rostagno Miguel Palma,Carmelo G. Short-term stability of soy isoflavones extracts: Sample conservation aspects [J]. Food chemistry,2005,93(3):557-564

The Extraction of Soybean Isoflavone from the Soybean Used for Dry Soyfoods

GU Jian-ming，JIANG Pan
（Shanghai Key Laboratory of Bio-Energy Crops，School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444，China）

Abstract：The effect of the pretreatment（soaking temperature，soaking time，soybean flake thickness and ultrasonic time）on soybean isoflavone leaching from the soybean used for dry soyfoods，was studied. According to higher content of soybean isoflavone and lower soluble soybean protein in the leaching liquor，opitimising pretreatment parameters（soaking for 12 h at 55℃，ultrasonic for 40 min，thickness 10 %）were obtained by orthogonal experiment L9（34），so 790.67 g of soybean isoflavone per ton was recovered.

Key words：soybean；soybean isoflavone；recovery；food

收稿日期：2015-01-06

作者簡介：顧建明（1961—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品營養(yǎng)與加工。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.030