柳甜甜，王金水，*，高蕓芳，李曉偉，周曉配，賈峰（.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州45000；.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州45000）

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酪蛋白酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征研究

柳甜甜1，王金水1，*，高蕓芳1，李曉偉2，周曉配1，賈峰1
（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001）

摘要：用超聲波對(duì)酪蛋白進(jìn)行預(yù)處理之后，利用胰蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，檢測(cè)酶解后產(chǎn)物的表面特征、粒度分布及二級(jí)結(jié)構(gòu)等指標(biāo)，探討酪蛋白酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征變化特征。結(jié)果表明：用超聲波輔助處理后，酪蛋白酶解液的酶解產(chǎn)物與未采用超聲波輔助處理的結(jié)果相比，產(chǎn)物的粒度更小且分布均勻，酪蛋白表面的孔洞化和層片化更快，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白酶解產(chǎn)物顆粒的粒度變小，分子量分布更加均勻；酪蛋白酶解產(chǎn)物中β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲減少，而β-轉(zhuǎn)角的含量增加。結(jié)果表明超聲波輔助處理對(duì)酶解酪蛋白有很好的促進(jìn)的作用。

關(guān)鍵詞：酪蛋白；酶解產(chǎn)物；二級(jí)結(jié)構(gòu)；超聲波；傅里葉紅外光譜（FTIR）

酪蛋白（casein，CN）是牛乳中的主要蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量大約為20 kDa～25 kDa，呈酸性，由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白等四類組分組成[1]，是一類含磷的蛋白質(zhì)[2]，能夠協(xié)助參與核酸、三磷酸腺苷（ATP）等重要的代謝活動(dòng)。但是由于這4種單體通過(guò)α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角等蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)形成了緊密的酪蛋白空間結(jié)構(gòu)，使其在人體內(nèi)消化困難，且易過(guò)敏，這些因素限制了酪蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。然而，近年來(lái)在酪蛋白水解物中發(fā)現(xiàn)很多具有重要生理功能的多肽，如：阿片肽[3]、降血壓肽[4]、抗血栓肽、免疫促進(jìn)肽[5]、促進(jìn)礦物離子吸收肽等，而這些多肽大約在1 000 Da左右，容易被腸道吸收[3]。這使得酪蛋白的水解成為研究的熱點(diǎn)[6]。

目前，蛋白質(zhì)的酶解改性是改善蛋白質(zhì)功能特性及其應(yīng)用范圍的一種有效方法[8]。胰蛋白酶用來(lái)水解酪蛋白的研究相對(duì)較多[5，9-10]，但主要集中在水解條件的優(yōu)化[11]、水解度、水解率及酶解產(chǎn)物中可溶性氮、氨基氮及肽氮含量[8]等較表觀方面的研究，而對(duì)酪蛋白水解過(guò)程中蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象的變化研究的相對(duì)較少。

本研究采用超聲波技術(shù)對(duì)酪蛋白進(jìn)行預(yù)處理，然后對(duì)其進(jìn)行酶解。以期研究結(jié)果能夠?yàn)槔业鞍酌附鈾C(jī)制提供線索，為制備生物活性肽，呈味肽等新產(chǎn)品提供技術(shù)支撐，拓寬酪蛋白在食品和非食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1材料

酪蛋白（蛋白含量82.84 %、水分11.96 %、灰分2.48 %）：河南省東方惠化工有限公司；胰蛋白酶（酶活1.13×105U/g）：美國(guó)Amresco公司；其它試劑均為分析純。

JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；LC1260高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；Quanta200掃描電子顯微鏡：美國(guó)FEI公司；BT-9300H激光粒度分布儀：丹東市百特儀器有限公司；WQF-510傅里葉紅外光譜儀：北京瑞利分析儀器公司。

1.2方法

1.2.1酪蛋白酶解的輔助條件及酶解條件

在室溫條件下，配置底物濃度為5 %酪蛋白懸浮液，調(diào)節(jié)至pH 8使其溶解，先將酪蛋白懸浮液置于超聲波細(xì)胞粉碎（25 kHz）機(jī)中，調(diào)整超聲波的輸出功率分別為160 W和400 W，設(shè)置超聲波處理時(shí)間為1 h，未經(jīng)超聲波處理酪蛋白懸浮液為對(duì)照。

酪蛋白酶解的條件為：酪蛋白底物濃度5 %，酶解溫度40°C，胰蛋白酶酶用量2 500 U/g酪蛋白。酶解一定時(shí)間后，迅速沸水浴10 min滅酶，冷卻至室溫，4 000 r/min離心20 min得上清液。

酶解之后的懸浮液一部分直接測(cè)定粒度的分布；另一部分冷凍干燥，所得固體樣品分別用于分子量分布、表面結(jié)構(gòu)測(cè)定和二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定。

1.2.2酶解產(chǎn)物的粒度分布測(cè)定

粒度分布采用激光粒度分布儀進(jìn)行測(cè)定，酶解液按1∶1000（質(zhì)量比）用去離子水稀釋，具體方法參見(jiàn)蘇銀杰等的方法[12]。每個(gè)樣品平行采集3次，取平均圖譜。

1.2.3酶解產(chǎn)物的分子量分布測(cè)定

采用高效體積排阻色譜（HPSEC）檢測(cè)超聲波處理酪蛋白的分子量分布情況。具體方法與步驟參考王金水等方法[13]。

1.2.4酶解產(chǎn)物表面結(jié)構(gòu)測(cè)定

采用掃描電子顯微鏡觀測(cè)酪蛋白及超聲波處理的酪蛋白樣品的表面結(jié)構(gòu)。取適量的酪蛋白及處理樣品，按掃描電子顯微鏡的要求制樣，進(jìn)行樣品的外觀掃描。

1.2.5酶解產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

采用傅里葉紅外光譜（FTIR）測(cè)定超聲波輔助處理酪蛋白及酶解產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。具體步驟如下：稱取固體樣品2 mg，加入200 mg溴化鉀充分研磨干燥，壓片，使用傅里變換葉紅外光譜儀進(jìn)行400 cm-1～4 000 cm-1波數(shù)掃描。選取波數(shù)為1 600 cm-1～1 700 cm-1波譜圖做傅里葉去卷積和二階導(dǎo)數(shù)圖譜，采用Gausse函數(shù)進(jìn)行多次擬合至殘差最小。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)個(gè)進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。結(jié)果通過(guò)SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行95 %和99 %水平方差分析檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與討論

2.1酪蛋白酶解產(chǎn)物懸液粒度分布特征

酪蛋白酶解液粒度分布及粒度分布累積含量見(jiàn)圖1。

圖1 A和B是未經(jīng)超聲波輔助處理酪蛋白酶解的粒徑分布圖，從圖可以看出，未經(jīng)酶解的酪蛋白粒徑分布范圍較寬，約為0.1 μm～70.0 μm。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白產(chǎn)物的粒度分布的峰值向左移動(dòng)，表明隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白酶解產(chǎn)物的粒徑逐漸變?。幻附?0 min時(shí)，粒度分布曲線呈現(xiàn)雙峰模式，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，曲線逐漸變?yōu)閱畏迥Ｊ剑硎玖椒植贾饾u均勻。圖1 C和D是160 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解的粒徑分布圖，從圖可以看出，酪蛋白酶解粒徑分布范圍相對(duì)較窄，約為0.2 μm～30.0 μm，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白酶解產(chǎn)物的粒度分布的峰值向左移動(dòng)，累積含量曲線左移，且曲線由平緩逐漸變?yōu)槎噶?，表明隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，酪蛋白酶解產(chǎn)物粒徑減小且分布集中。圖1 E和F是400 W超聲波輔助處理的酪蛋白粒徑分布圖，從圖可以看出，酪蛋白及酶解產(chǎn)物粒徑分布范圍相對(duì)較窄，約為0.1 μm～30.0 μm；與160 W輔助處理的酪蛋白酶解產(chǎn)物的粒度分布值相比，可以看出，400 W處理在酶解40 min時(shí)的粒度分布峰值更小，表明在同樣的酶解時(shí)間內(nèi)，經(jīng)過(guò)大功率預(yù)測(cè)處理的酪蛋白更加容易酶解。

利用超聲波輔助處理后酪蛋白酶解液粒度分布情況進(jìn)行積分得表1。

圖1　酪蛋白酶解液粒度分布及粒度分布累積含量圖Fig.1 The chart of particle size distribution and the cumulative content of particle size distribution in the casein enzymolysis liquid

表1　超聲波輔助處理對(duì)酪蛋白酶解液粒度分布的影響Table 1 The influence of ultrasonic pretreatment on particle size distribution of casein enzymolysis products

續(xù)表1超聲波輔助處理對(duì)酪蛋白酶解液粒度分布的影響

Continue table 1 The influence of ultrasonic pretreatment on particle size distribution of casein enzymolysis products

注：D表示顆粒直徑，D（x）指一個(gè)樣品的累積粒度分布達(dá)到x %時(shí)所對(duì)應(yīng)的粒徑；其中，D（50）表示中位徑；D（4，3）表示體積平均徑及D （3，2）表示表面積平均徑，兩數(shù)值越接近，表示顆粒形狀越規(guī)則，越接近于球形。

由表1可知，對(duì)于對(duì)照試驗(yàn)，隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，D（50）、D（90）、D（4，3）總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但各相鄰點(diǎn)之間變化不明顯。而經(jīng)過(guò)超聲波（160 W和400 W）處理后的酪蛋白酶解產(chǎn)物分析表明，D（90）呈顯著下降趨勢(shì)（P < 0.05），表明在酶解過(guò)程中，經(jīng)超聲波處理后的酪蛋白大顆粒物質(zhì)更易被分解為小顆粒；與對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果相比，經(jīng)超聲波（160 W和400 W）處理后，酪蛋白酶解產(chǎn)物D（50）、D（90）、D（100）、D（4，3）均有所下降。經(jīng)超聲波處理后的酪蛋白經(jīng)過(guò)為20、30 min的酶解，其酶解產(chǎn)物D（90）、D（100）明顯小于對(duì)照試驗(yàn)（P < 0.01），且400 W處理明顯強(qiáng)于160 W處理（P < 0.01）。但當(dāng)酶解時(shí)間到40 min～80 min時(shí)，超聲波處理不能夠顯著影響酶解產(chǎn)物粒徑的累積分布。D（4，3）、D （3，2）隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，呈下降趨勢(shì)，且比值越來(lái)越小，表明隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物在水中越來(lái)越接近于球形。

2.2酪蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布特征

酪蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布的積分換算見(jiàn)表2。

表2　超聲波處理對(duì)酪蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布的影響Table 2 The inflDaence of ultrasonic pretreatment on molecular weight distribution of casein enzymolysis products

由表2可以看出，分子量>20 000 Da的多肽含量，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)而減少，而<1 000 Da的多肽含量逐漸增多，中間分子量的多肽，表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化，說(shuō)明是中間過(guò)渡形態(tài)。對(duì)160和400 W超聲波輔助處理1 h后酪蛋白的酶解結(jié)果，經(jīng)400 W超聲波輔助處理后酶解的小片段更多，則酶解效果更明顯。

2.3酪蛋白酶解產(chǎn)物表面結(jié)構(gòu)特征

未超聲波輔助處理酪蛋白不同酶解時(shí)間后表面的結(jié)構(gòu)、160 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解不同時(shí)間后表面的結(jié)構(gòu)和400 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解不同時(shí)間后表面的結(jié)構(gòu)結(jié)果分別見(jiàn)圖2～圖4。

圖2　未超聲波輔助處理酪蛋白不同酶解時(shí)間后表面的結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The surface structure of the same casein（without ultrasonic pretreated）at the different time of enzymolysis

圖3　160 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解不同時(shí)間后表面的結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The surface structure of the same casein（ultrasonic pretreated by 160 W）at the different time of enzymolysis

圖4　400 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解不同時(shí)間后表面的結(jié)構(gòu)圖Fig.4 The surface structure of the same casein（ultrasonic pretreated by 400 W）at the different time of enzymolysis

未經(jīng)超聲波輔助處理酪蛋白酶解過(guò)程中（10 min～80 min）蛋白的表面結(jié)構(gòu)變化如圖2A-F，可以看出，酪蛋白酶解10 min時(shí)其表面就出現(xiàn)酶解的小孔，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解的孔洞逐漸增大，到40 min時(shí)，酪蛋白的表面出現(xiàn)層疊狀，進(jìn)而酶解之后，層片逐漸減小。表明酪蛋白的膠團(tuán)表面逐步破碎。經(jīng)160 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解過(guò)程（10 min～80 min）產(chǎn)物的表面結(jié)構(gòu)變化如圖3 A～F所示，可以看出，與對(duì)照試驗(yàn)相比，經(jīng)160 W超聲波處理1 h后，酶解10 min～20 min時(shí)其表面酶解的小孔更加均勻，呈現(xiàn)“蜂窩狀”，到30 min時(shí)，酪蛋白的表面出現(xiàn)層疊狀，比未處理的提前出現(xiàn)層片結(jié)構(gòu)，逐漸減小。表明酪蛋白經(jīng)超聲波處理后，其酶解反應(yīng)能更加深層次地進(jìn)行。經(jīng)400 W超聲波輔助處理酪蛋白酶解過(guò)程（10 min～80 min）產(chǎn)物的表面結(jié)構(gòu)變化如圖4A～F所示，與對(duì)照和160 W的試驗(yàn)相比，經(jīng)400 W超聲波輔助處理1 h后，酪蛋白酶解10 min時(shí)其表面就呈現(xiàn)“蜂窩狀”，到20 min時(shí)，酪蛋白中的酶解小孔變大，到30 min時(shí)，酪蛋白的表面出現(xiàn)層疊狀，到40 min時(shí)，酪蛋白酶解的膠團(tuán)表面結(jié)構(gòu)疏松，有利于酶解的立體化進(jìn)行。

2.4酪蛋白酶解產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)特征

酪蛋白及經(jīng)超聲波后酶解產(chǎn)物的傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。

圖5　酪蛋白酶解產(chǎn)物傅里葉紅外光譜圖Fig.5 The Fourier infrared spectrum of casein enzymolysis products

經(jīng)超聲波160W輔助處后與對(duì)照相比，在2000cm-1～2 400 cm-1處有明顯的變化。但是，對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和應(yīng)用最為廣泛的是對(duì)酰胺Ⅰ帶（波數(shù)1 700 cm-1～1 600 cm-1）進(jìn)行去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合處理，且認(rèn)為1 610cm-1～1640cm-1為β-折疊，1 640 cm-1～1 650 cm-1為無(wú)規(guī)則卷曲，1 650 cm-1～1 658 cm-1為α-螺旋，1 660cm-1～1700cm-1為β-轉(zhuǎn)角。

對(duì)未經(jīng)超聲波和超聲波處理后的酪蛋白及其酶解產(chǎn)物的紅外光譜酰胺I帶（1 600 cm-1～1 700 cm-1）進(jìn)行去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合處理，并統(tǒng)計(jì)酪蛋白酶解產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，見(jiàn)表3。

表3　酪蛋白酶解產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)含量統(tǒng)計(jì)表Table 3 The secondary structure of casein enzymolysis products

由表3可知，酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解之后，α-螺旋含量均下降，α-螺旋/β-折疊也不同程度減小，酶解10 min時(shí)變化已經(jīng)很明顯；與對(duì)照試驗(yàn)相比，經(jīng)160、400 W超聲波處理1 h后的酪蛋白，在經(jīng)過(guò)同等酶解時(shí)間處理，其酶解產(chǎn)物中的α-螺旋/β-折疊有所下降，表明經(jīng)超聲波輔助處理的酪蛋白，其酶解產(chǎn)物柔韌性增大。經(jīng)160和400 W超聲預(yù)處理1 h后，在酶解20 min時(shí)，其產(chǎn)物中的α-螺旋/β-折疊分別為0.28、0.27，二者之間結(jié)果差異不顯著；但酶解40 min后，則其二者之間產(chǎn)物中的α-螺旋/β-折疊結(jié)果有顯著差異（0.29、0.45）。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)用超聲波對(duì)酪蛋白進(jìn)行預(yù)處理之后，利用胰蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，檢測(cè)酶解后產(chǎn)物的表面特征、粒度分布及二級(jí)結(jié)構(gòu)等指標(biāo)，結(jié)果表明，用超聲波輔助處理后，酪蛋白酶解液的酶解產(chǎn)物與未采用超聲波輔助處理的結(jié)果相比，產(chǎn)物的粒度更小且分布均勻，酪蛋白表面的孔洞化和層片化更快，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酪蛋白酶解產(chǎn)物顆粒的粒度變小，分子量分布更加均勻；酪蛋白酶解產(chǎn)物中β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲減少，而β-轉(zhuǎn)角的含量增加。說(shuō)明超聲波輔助處理對(duì)酶解酪蛋白有很好的促進(jìn)的作用。

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Study on the Structural Characteristics of Casein Hydrolysis Products

LIU Tian-tian1，WANG Jin-shui1，*，GAO Yun-fang1，LI Xiao-wei2，ZHOU Xiao-pei1，JIA Feng1
（1. College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，Henan，China；2. School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，Henan，China）

Abstract：The characteristics of the product in the process of digestion with trypsin after the enzymolysis of the ultrasonic pretreated casein were studied. The particle size distribution of caseian were measured with laser particle size distribution analyzer，and the surface characteristics of casein were detected by the electronic scanning electron microscopy（SEM），and the secondary structure changes in casein were measured with Fourier infrared spectrum. The results showed that it was easy to make holes or layers in the dense surface structure of ultrasonic pretreated casein than the untreated casein. The larger casein particles changed into smaller one and molecular weight distribution became more uniform. These changes made the originally dense surface structure of casein to become relatively incompact and increase the specific surface area. These changes were conducivebook=15,ebook=22to the subsequent enzymolysis. The beta angle and random curl reduced as well as the contents of beta angle increased in casein after enzymolysis. The results showed that it had a good effect on the enzymatic hydrolysis of casein with ultrasonic assisted treatment.

Key words：casein；enzymatic hydrolysates；secondary structure；ultrasonic；Fourier transform infrared spectroscopy（FTIR）

收稿日期：2015-02-04

*通信作者：王金水（1964—），男（漢），教授，博士，研究方向：糧食生物技術(shù)。

作者簡(jiǎn)介：柳甜甜（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：糧食生物技術(shù)。

基金項(xiàng)目：河南工業(yè)大學(xué)博士基金項(xiàng)目（2012BS013）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（13A550166）；鄭州市普通科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（N2013G0077）；河南工業(yè)大學(xué)?；A(chǔ)研究重點(diǎn)培育基金（2013JCYJ05）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.004