邵言蹊，劉大松，徐 姝，李志賓，周 鵬

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

羊乳易消化[1]、不易產(chǎn)生乳糖不耐癥和過敏反應(yīng)，其諸多營養(yǎng)價值和功能特性均優(yōu)于牛乳[2]。近年來，基于羊乳的液態(tài)奶、奶酪、酸奶、嬰幼兒配方奶粉等乳制品的消費者接受度和市場份額正逐步擴(kuò)大[3]。羊乳中乳清蛋白和酪蛋白的質(zhì)量比為30∶70，其中酪蛋白部分主要包括β、αs1、αs2和κ型，其占比為55%、6%、19%、20%；牛乳中乳清蛋白和酪蛋白的質(zhì)量比例為20∶80，酪蛋白部分主要含β、αs1、αs2和κ型，其占比為36%、40%、10%、14%；人乳中乳清蛋白與酪蛋白的質(zhì)量比為60∶40，酪蛋白部分主要含β、αs1、κ型，占比為68%、12%、20%[4]。相較于牛乳，羊乳在蛋白質(zhì)組成和配比方面與人乳更接近。α-酪蛋白為乳中主要的過敏原，羊乳中的α-酪蛋白含量較少，且β-酪蛋白含量較牛乳多[5]。因此，羊乳更適用于嬰幼兒配方乳粉的生產(chǎn)。

目前，嬰幼兒配方乳粉的母乳化研制主要集中在增加乳清蛋白含量方面，較少考慮酪蛋白配比的差異[6]。提高嬰幼兒配方乳粉中β-酪蛋白與乳清蛋白的含量，可使其與人乳蛋白組成更為接近，更有利于嬰幼兒消化吸收。乳中的酪蛋白主要以膠束形式存在，而乳清蛋白游離在膠束外面的乳清中。在膠束中，部分β-酪蛋白和α-酪蛋白通過它們所帶的磷酸基團(tuán)和膠體磷酸鈣相互作用，從而形成膠束骨架結(jié)構(gòu)，還有部分β-酪蛋白是通過疏水作用在膠束骨架上結(jié)合[7]。β-酪蛋白是疏水性較強(qiáng)的酪蛋白，在低溫作用下，會減弱蛋白的疏水作用，使部分β-酪蛋白從膠束中解離到乳清中，并以分子單體或者低相對分子質(zhì)量聚集體形式存在[8]。Liu等在4℃條件下采用30 nm孔徑陶瓷膜微濾處理脫脂牛乳，使游離的β-酪蛋白和乳清蛋白同時富集到透過液中，進(jìn)而通過超濾脫糖脫鹽，再經(jīng)噴霧干燥脫水，制備了富含β-酪蛋白和乳清蛋白的乳蛋白配料[9]。

作者以山羊脫脂乳為原料，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、反相高效液相色譜（RPHPLC）、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）等分析方法，研究溫度、平衡時間、pH、NaCl濃度、檸檬酸鈉濃度、CaCl2濃度對β-酪蛋白從膠束中解離的影響，旨在為羊乳β-酪蛋白的低溫微濾分離提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮羊乳：杭州云泉約牧業(yè)有限公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇、三氟乙酸：美國Sigma公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇：賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、β-巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、四甲基乙二胺、甲叉丙烯酰胺、過硫酸銨、尿素：上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

CLARA 20LFCO乳脂分離器：瑞典Alfa Laval公司產(chǎn)品；GCM-C-30陶瓷膜分離系統(tǒng)：廈門國初科技有限公司產(chǎn)品；Optima L-100XP超速離心機(jī)：美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；E2695高效液相色譜分析儀：美國Waters公司產(chǎn)品；PROTEAN II XL電泳系統(tǒng)、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；ICAP TQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：德國Thermo公司產(chǎn)品；LRH-250CA低溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 誘導(dǎo)解離及其分離羊乳經(jīng)乳脂分離器去除奶油，收集生鮮脫脂羊乳，使用1.4μm孔徑陶瓷膜進(jìn)行除菌處理。取除菌脫脂羊乳，進(jìn)行不同的β-酪蛋白誘導(dǎo)解離處理，而后在100 000 g下離心60 min，取上清液進(jìn)行后續(xù)組分分析。不同溫度誘導(dǎo)處理：25、20、15、10、4℃，120 min；不同平衡時間處理：0、15、30、60、120、180、240 min，4℃；不同pH值處理：6.7、6.4、6.2、6.0、5.8、5.6、5.4，4℃，120 min； 不 同NaCl濃 度 處 理：0、25、50、100、150、250 mmol/L，4℃，120 min；不同檸檬酸鈉濃度處理：0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mmol/L，4℃，120 min；不同CaCl2濃度 處 理：0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0 mmol/L，4℃，120 min。

1.3.2 電泳分析取1.3.1中脫脂羊乳及超速離心上清液，采用超純水稀釋8倍，與樣品緩沖液等體積混合，其中樣品緩沖液中含有體積分?jǐn)?shù)5%的β-巰基乙醇，沸水條件下水浴3 min，而后立即冷卻，每個樣品上樣量均為20μL。濃縮膠和分離膠質(zhì)量濃度分別為4、13 g/dL，所采用的電流強(qiáng)度分別為20、45 mA。

1.3.3 高效液相色譜分析取1.3.1中脫脂羊乳及超速離心上清液，與緩沖液1（0.1 mol/L Bis-Tris丙烷，pH 7，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.3%檸檬酸鈉、8 mom/L尿素、20 mmol/L DTT）以體積比1∶1進(jìn)行混合，室溫條件下，在旋轉(zhuǎn)振蕩器上振蕩1 h，然后在10 000 g條件下離心5 min，將上清液與緩沖液2（V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=100∶900∶1）以體積比1∶3進(jìn)行混合，然后過0.45μm的有機(jī)膜。采用C8色譜柱，上樣量40μL，梯度洗脫所采用的流動相A、B中乙腈、水、三氟乙酸的體積比分別為100∶900∶1和900∶100∶0.7，流量0.8 mL/min，檢測波長為220 nm[10]。采用Empower軟件對各個色譜峰的面積進(jìn)行積分。

1.3.4 電感耦合等離子體質(zhì)譜分析取1.3.1中脫脂羊乳及超速離心上清液1 mL于消解管內(nèi)，加入3.2 mL硝酸，進(jìn)行微波消解，采用超純水定容到50 mL，采用ICP-MS進(jìn)行鈣含量的測定。脫脂乳鈣含量減去超速離心上清液鈣含量，所得到的差值，即是膠束鈣含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析，用Ducan’stest比較均值之間的差異，P<0.05時表明存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

不同溫度下平衡120 min后脫脂羊乳中游離蛋白的組成如圖1所示。游離蛋白部分主要含有β-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，還含少量κ-酪蛋白、α-酪蛋白以及一些高相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。隨處理溫度的降低，3種游離酪蛋白所對應(yīng)的條帶強(qiáng)度均逐漸增加，兩種主要游離乳清蛋白的條帶強(qiáng)度無顯著變化，都與脫脂羊乳中對應(yīng)蛋白的條帶強(qiáng)度相接近。

圖1 不同溫度處理脫脂羊乳中游離蛋白質(zhì)的電泳圖Fig.1 SDS-PAGE patterns of free proteins in goat skim milk incubated at different temperature

2.1 不同溫度對膠束態(tài)β-酪蛋白解離的影響

不同溫度下平衡120 min后脫脂羊乳中游離β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及各游離酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖2所示。隨處理溫度從25℃降低到4℃，3種游離酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均逐漸增加，其中β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由6.9%增加至36.5%，κ-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由12.1%增加至25.5%，α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由4.7%增加至10.1%，3種游離酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增幅均在15~4℃達(dá)最大。隨處理溫度的降低，3種游離酪蛋白中，β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，κ-酪蛋白和α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都逐漸降低。在25℃時，各游離酪蛋白的占比以κ-酪蛋白為主，β-酪蛋白略低，α-酪蛋白相對微少，其中游離κ-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于脫脂乳中κ-酪蛋白所對應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，游離β-酪蛋白和α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都低于脫脂乳中各蛋白所對應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；在20℃及以下時，游離β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，且高于脫脂乳中β-酪蛋白所對應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

不同溫度下平衡120 min后脫脂羊乳中膠束鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖3所示。處理溫度從25℃降低到4℃，膠束鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)由71.1%降低至63.2%，降幅在20~4℃較大。磷酸鈣在脫脂羊乳的乳清中一直處于飽和的溶解狀態(tài)，且和膠束態(tài)酪蛋白中的膠體磷酸鈣分布平衡[11]。乳清液中磷酸鈣的飽和溶解度隨溫度降低而增加，進(jìn)而促使膠體磷酸鈣的解離，重新建立磷酸鈣的飽和溶解狀態(tài)。β-酪蛋白是疏水性最強(qiáng)的酪蛋白，在膠束結(jié)構(gòu)中，一部分β-酪蛋白通過其所帶的磷酸基團(tuán)與膠體磷酸鈣相互作用，參與膠束骨架結(jié)構(gòu)形成，另一部分β-酪蛋白則通過疏水作用結(jié)合到膠束骨架上[12]。在低溫作用下，會減弱蛋白之間的疏水作用，通過疏水作用結(jié)合的部分β-酪蛋白質(zhì)將逐漸從膠束解離到乳清中。此外，低溫條件下膠束鈣含量的降低，使得膠束中通過疏水作用結(jié)合的β-酪蛋白的含量增加，進(jìn)一步促使低溫條件下β-酪蛋白從膠束中的解離[13]。

圖2 不同溫度處理脫脂羊乳中游離β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-酪蛋白及各游離酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.2 Contents of freeβ-casein，κ-casein，α-casein and ratios of each free caseins in goat skim milk incubated at different temperature

2.2 不同平衡時間對膠束態(tài)β-酪蛋白解離的影響

4℃下平衡不同時間后脫脂羊乳中各游離酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及占比如圖4所示。在平衡時間0~120 min，3種游離酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均逐漸增加，在隨后的120~240 min趨于平穩(wěn)不變，其中β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由17.1%增加至44.4%，κ-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由8.1%增加至33.7%，α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由6.7%增加至14.8%，3種游離酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增幅均在0~15 min達(dá)最大。隨平衡時間的增加，3種游離酪蛋白中，β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，κ-酪蛋白和α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低。上述結(jié)果表明，低溫誘導(dǎo)的羊乳酪蛋白膠束內(nèi)部結(jié)構(gòu)重排及膠束態(tài)β-酪蛋白的解離在120 min后達(dá)到平衡狀態(tài)。

圖3 不同溫度處理脫脂羊乳中膠束鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.3 Contents of colloidal calcium in goat skim milk incubated at different temperature

圖4 4℃下不同平衡時間處理脫脂羊乳中游離β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-酪蛋白及各游離酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.4 Contents of freeβ-casein，κ-casein，α-casein and ratios of each free caseins in goat skim milk incubated for different time at 4℃

2.3 不同pH對膠束態(tài)β-酪蛋白解離的影響

4℃下不同pH脫脂羊乳中各游離酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖5所示。在pH 6.7~5.8，3種游離酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均逐漸增加，在隨后的pH 5.8~5.4趨于平穩(wěn)不變，其中β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由31.4%增加至47.2%，κ-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由16.9%增加至25.3%，α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由7.7%增加至23.0%，β-酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增幅在pH 6.2~5.8達(dá)最大，κ-酪蛋白和α-酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增幅均在pH 6.0~5.8達(dá)最大。在pH 6.7~6.0，3種游離酪蛋白中，β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有增加；在pH 6.0~5.8，β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低；在pH 5.8~5.4，β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨于穩(wěn)定不變。游離α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在pH 6.7~5.8逐漸增加，在pH 5.8~5.4則趨于穩(wěn)定不變。游離κ-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在pH 6.7~6.0逐漸降低，在pH 6.0~5.8顯著增加，在pH 5.8~5.4則趨于穩(wěn)定不變。

4℃下不同pH脫脂羊乳中膠束鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖6所示。隨pH從6.7降低到5.4，膠束鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)由65.2%降低至37.1%。磷酸根離子的質(zhì)子化程度隨pH降低而增加，從而導(dǎo)致磷酸鈣飽和溶解度增加，使膠體磷酸鈣解離，重新建立磷酸鈣飽和溶解平衡。膠束態(tài)酪蛋白分子上，負(fù)電荷基團(tuán)逐漸暴露（如磷酸基和羧酸基），然后發(fā)生質(zhì)子化，且乳清離子強(qiáng)度的增加會增加負(fù)電荷基團(tuán)所受的靜電屏蔽作用，進(jìn)而降低脫鈣膠束內(nèi)部鄰近酪蛋白分子之間的靜電排斥力，脫鈣膠束主要在疏水作用的維持下保持一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)[14]。這也使得膠束中通過疏水作用結(jié)合的β-酪蛋白的含量增加，促使低溫條件下β-酪蛋白從膠束中的解離。

圖5 4℃下不同pH處理脫脂羊乳中游離β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-酪蛋白及各游離酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.5 Contents of freeβ-casein，κ-casein，α-casein and ratios of each free caseins in goat skim milk incubated at different pH at 4℃

圖6 4℃下不同pH處理脫脂羊乳中膠束鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.6 Contents of colloidal calcium in goat skim milk incubated at different pH at 4℃

2.4 不同NaCl濃度對膠束態(tài)β-酪蛋白解離的影響

4℃下不同NaCl濃度的脫脂羊乳中各游離酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及占比如圖7所示。隨NaCl濃度從0 mmol/L增加到250 mmol/L，3種游離酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈增加趨勢，其中β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由30.5%增加至37.25%，κ-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由19.7%增加至26.4%，α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由7.3%增加至19.3%。隨NaCl濃度的增加，3種游離酪蛋白中，β-酪蛋白的占比逐漸降低，κ-酪蛋白和α-酪蛋白的占比逐漸增加。添加NaCl使脫脂羊乳乳清的離子強(qiáng)度增加[15]，促使膠束鈣的解離，膠束中通過疏水作用結(jié)合的β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，進(jìn)而促使低溫條件下β-酪蛋白從膠束中的解離。

2.5 不同檸檬酸鈉濃度對膠束態(tài)β-酪蛋白解離的影響

不同檸檬酸鈉濃度的脫脂羊乳中各游離酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖8所示，3種游離酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在檸檬酸鈉濃度0~3 mmol/L時均呈增加趨勢，在3~5 mmol/L時趨于平穩(wěn)。β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由30.5%增加至38.1%，κ-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由19.7%增加至26.0，α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由7.3%增加至13.8%。隨檸檬酸鈉添加濃度的增加，3種游離酪蛋白中，β-酪蛋白和α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都略有增加，κ-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低。

圖7 4℃下不同NaCl濃度處理脫脂羊乳中游離β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-酪蛋白及各游離酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.7 Contents of freeβ-casein，κ-casein，α-casein and ratios of each free caseins in goat skim milk incubated with different added concentration of NaCl at 4℃

4℃下不同檸檬酸鈉濃度處理脫脂羊乳中膠束鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖9所示。檸檬酸鈉濃度從0 mmol/L增加到5 mmol/L，膠束鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)由65.4%降低至53.2%。添加的螯合劑與脫脂羊乳乳清中游離的鈣離子相結(jié)合，從而使膠束鈣解離到乳清中，磷酸鈣的飽和溶解狀態(tài)重新建立。膠束態(tài)酪蛋白分子上的負(fù)電荷基團(tuán)隨之暴露，增加了脫鈣膠束內(nèi)部鄰近酪蛋白分子之間的靜電排斥力，使膠束態(tài)酪蛋白解離到乳清中。膠束中通過疏水作用結(jié)合的β-酪蛋白的含量增加，進(jìn)一步促使低溫條件下β-酪蛋白從膠束中解離[16-17]。

2.6 不同CaCl2濃度對膠束態(tài)β-酪蛋白解離的影響

4℃下不同CaCl2濃度處理脫脂羊乳中各游離酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖10所示。CaCl2濃度從0 mmol/L增加到25 mmol/L，3種游離酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈降低趨勢，其中β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由30.5%減少至15.9%，κ-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由19.7%減少至6.8%；α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由7.3%減少至4.8%，3種游離酪蛋白中，β-酪蛋白和κ-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈逐漸減少趨勢，α-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈逐漸增加趨勢。添加CaCl2使脫脂羊乳乳清中磷酸鈣處于過飽和狀態(tài)，促使游離鈣離子結(jié)合到膠束中，增加膠束鈣含量，膠束中通過疏水作用結(jié)合的β-酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，從而減少低溫條件下β-酪蛋白從膠束中的解離[18-19]。

圖8 4℃下不同檸檬酸鈉濃度處理脫脂羊乳中游離β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-酪蛋白及各游離酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.8 Contents of freeβ-casein，κ-casein，α-casein and ratios of each free caseins in goat skim milk incubated with different added concentration of sodium citrate at 4℃

圖9 4℃下不同檸檬酸鈉濃度處理脫脂羊乳中膠束鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.9 Contents of colloidal calcium in goat skim milk incubated with different added concentration of sodium citrate at 4℃

3 結(jié)語

溫度、平衡時間、pH、NaCl濃度、檸檬酸鈉濃度、CaCl2濃度對羊乳中β-酪蛋白從膠束中的解離有顯著影響。在羊乳酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)中，部分β-酪蛋白通過疏水作用與膠束骨架相結(jié)合，在低溫作用下，會減弱蛋白質(zhì)之間的疏水作用，通過疏水作用結(jié)合的部分β-酪蛋白從膠束中解離。低溫誘導(dǎo)膠束鈣的解離，使得膠束中通過疏水作用結(jié)合的β-酪蛋白的含量增加，促進(jìn)低溫條件下β-酪蛋白從膠束中的解離。低溫誘導(dǎo)膠束態(tài)β-酪蛋白的解離在120 min后達(dá)到平衡狀態(tài)。降低pH及添加檸檬酸鈉和NaCl促進(jìn)膠束鈣的解離，增加膠束中通過疏水作用結(jié)合的β-酪蛋白的含量，進(jìn)一步促使低溫條件下β-酪蛋白從膠束中的解離。上述結(jié)果將為羊乳中β-酪蛋白的低溫微濾分離提供參考。

圖10 4℃下不同CaCl2濃度處理脫脂羊乳中游離β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-酪蛋白及各游離酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.10 Contents of freeβ-casein，κ-casein，α-casein and ratios of each free caseins in goat skim milk incubated with different concentration of CaCl2 at 4℃