謝耀聰，俞建峰*，石 賽

（1.江南大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省食品先進(jìn)制造裝備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

茶多酚是茶葉中多酚類化合物的總稱，是一種安全無毒、無副作用的純天然提取物[1]。茶多酚中含有較多羥基，能夠有效抑制氧化酶活性，阻止氧化過程中的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力[2]，具有清除自由基[3]、抗衰老[4]、抗癌[5]、降血脂[6]等生物活性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[7-9]。因此，茶多酚的檢測(cè)分析對(duì)茶多酚制品的品質(zhì)控制具有重要意義。

目前茶多酚的檢測(cè)方法主要有福林酚法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[10]，雖然這些方法檢測(cè)精度高，但也存在操作復(fù)雜、分析時(shí)間長(zhǎng)、儀器成本高等缺點(diǎn)。循環(huán)伏安法和安培滴定法等電化學(xué)技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高和儀器成本低等優(yōu)點(diǎn)[11]，已成為一種茶多酚檢測(cè)的新方法，但現(xiàn)有的茶多酚電化學(xué)檢測(cè)過程仍存在自動(dòng)化程度低，試劑樣品用量大等[12]缺陷。

微流控是一種在微米尺度的通道中實(shí)現(xiàn)微液滴操縱、沉淀反應(yīng)、分離及檢測(cè)等功能的技術(shù)[13]。微流控芯片中可集成生物酶、微電極等結(jié)構(gòu)，并借助檢測(cè)儀器實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的定量分析，減少了試劑用量，實(shí)現(xiàn)樣品預(yù)處理到檢測(cè)分析的整體微型化、集成化與便攜化[14-15]。開展微流控和電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的茶多酚檢測(cè)方法的研究尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

作者提出了一種基于微流控芯片的茶多酚電化學(xué)檢測(cè)方法，將茶多酚檢測(cè)過程中的進(jìn)料、混合和循環(huán)伏安檢測(cè)功能集成在微流控芯片上，采用3D打印技術(shù)制造微流控芯片，以微流控芯片為檢測(cè)通道，絲網(wǎng)印刷電極為電化學(xué)傳感器，建立了微流控檢測(cè)平臺(tái)，通過實(shí)驗(yàn)對(duì)檢測(cè)過程中的緩沖液種類、緩沖液pH、掃描速度和進(jìn)料流量等4個(gè)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最后運(yùn)用該方法測(cè)定普洱茶樣品的茶多酚含量，并與標(biāo)準(zhǔn)福林酚法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于合肥博美生物公司；普洱茶樣品：購(gòu)于云南普洱茶（集團(tuán)）有限公司；福林酚、碳酸鈉、氯化鉀、濃硫酸，配置PBS緩沖液的磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，配置CBS緩沖液的檸檬酸、磷酸氫二鈉、配置B-R緩沖液的硼酸、乙酸、氫氧化鈉：購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；其他試劑均為分析純，使用前未進(jìn)行純化；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.1.2 儀器CHI660E電化學(xué)工作站：上海辰華儀器公司產(chǎn)品；注射泵：蘇州汶顥微流控技術(shù)有限公司產(chǎn)品；微流控芯片：江南大學(xué)食品加工技術(shù)與裝備研究中心自制；絲網(wǎng)印刷碳電極：市售；精密電子分析天平：奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品；722可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.2 微流控芯片研制

為了滿足微流控檢測(cè)平臺(tái)對(duì)茶多酚的檢測(cè)需求，設(shè)計(jì)了具有自動(dòng)進(jìn)料、混合和循環(huán)伏安檢測(cè)功能的微流控芯片，模型如圖1所示。A為芯片的進(jìn)料通道，通過PTFE導(dǎo)管分別與注射泵的兩個(gè)微量進(jìn)樣器連接，實(shí)現(xiàn)緩沖液和待測(cè)樣品的自動(dòng)進(jìn)料功能；B為混合通道，將緩沖液和待測(cè)樣品進(jìn)行充分混合，為循環(huán)伏安法提供穩(wěn)定的檢測(cè)環(huán)境，混合是茶多酚檢測(cè)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如果混合不均勻?qū)a(chǎn)生較大的檢測(cè)誤差，因此將混合通道設(shè)計(jì)成內(nèi)肋形微混合結(jié)構(gòu)，文獻(xiàn)報(bào)道并驗(yàn)證了此結(jié)構(gòu)混合效率高，混合均勻性好[16]。C為電化學(xué)檢測(cè)區(qū)，D為廢液出口，E為電極插口?？杉缮唐坊z網(wǎng)印刷電極，降低了微電極高昂的制作成本，絲網(wǎng)印刷電極為三電極結(jié)構(gòu)，工作電極和輔助電極為碳墨電極，參比電極為Ag/AgCl電極。

圖1 微流控芯片結(jié)構(gòu)模型Fig.1 Structure model of microfluidic chip

微流控芯片由Micro Plus Advantage 3D打印機(jī)（EnvieionTEC，德國(guó)）采用DLP技術(shù)打印成型，芯片材料為Formlabs耐高溫光敏樹脂。

1.3 檢測(cè)平臺(tái)搭建

圖2為微流控檢測(cè)平臺(tái)示意圖，主要由注射泵（行程分辨率：0.078μm）、微流控芯片（自制）、絲網(wǎng)印刷電極、電化學(xué)工作站和計(jì)算機(jī)組成。微流控芯片的接口處均采用熱熔膠密封，防止溶液泄漏。注射泵通過微量進(jìn)樣器以一定的進(jìn)料流量將緩沖液和待測(cè)樣品分別注入微流控芯片的進(jìn)料通道，兩種溶液混合均勻后到達(dá)電化學(xué)檢測(cè)區(qū)，絲網(wǎng)印刷電極通過適配器與電化學(xué)工作站連接，電化學(xué)工作站采用循環(huán)伏安法測(cè)得氧化峰電流與沒食子酸濃度的定量關(guān)系，進(jìn)而應(yīng)用于茶多酚的檢測(cè)分析。

圖2 微流控檢測(cè)平臺(tái)示意圖Fig.2 Schematic diagram of microfluidic detection platform

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備沒食子酸母液制備：稱取0.171 g的沒食子酸（gallic acid，GA）標(biāo)準(zhǔn)品加入燒杯中，用去離子水充分溶解后，移至100 mL容量瓶中定容。將母液稀釋成5～1 250μmol/L共13個(gè)不同濃度的沒食子酸溶液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 樣品制備普洱茶樣品母液制備：將15 mL體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇溶液置于70℃水浴鍋中預(yù)熱，普洱茶樣品置于碾磨缽中碾磨，稱取0.2 g碾磨后的樣品于8 mL離心試管中，加入5 mL預(yù)熱后的甲醇溶液，充分?jǐn)嚢?，立即轉(zhuǎn)至70℃水浴鍋中保溫10 min，取出后降到室溫，在3 500 r/min的離心機(jī)中離心10 min，上層清液移至10 mL容量瓶中，殘?jiān)偬崛∫淮?，另用濾紙過濾兩次，合并兩次清液加去離子水定容到10 mL，搖勻，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 電極活化絲網(wǎng)印刷碳電極的活化方法1：將電極插入飽和碳酸鈉溶液中，采用計(jì)時(shí)電流法，恒電位為1.2 V，掃描5 min；方法2：將電極置于0.5 mol/L稀硫酸溶液中，采用循環(huán)伏安法掃描至穩(wěn)定。電極活化后集成至微流控檢測(cè)平臺(tái)上，采用循環(huán)伏安法，進(jìn)料流量為40μL/min，以100 mV/s進(jìn)行掃描，電解質(zhì)為B-R緩沖液（pH 3.0）。在此條件下，研究沒食子酸的電化學(xué)行為，選擇最佳的電極活化方法。

1.4.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

1）研究緩沖液種類和pH的影響 制備0.1 mol/L的B-R，PBS，CBS 3種緩沖液（pH 3.0）。注射泵的檢測(cè)樣品進(jìn)樣器吸取500μmol/L的沒食子酸溶液2 mL，緩沖液進(jìn)樣器每次吸取與沒食子酸等量的緩沖液，設(shè)定注射泵的進(jìn)料流量為40μL/min，以100 mV/s進(jìn)行掃描，同一條件下連續(xù)檢測(cè)5次，取氧化峰電流的平均值。更換緩沖液進(jìn)樣器中的緩沖液，重復(fù)檢測(cè)步驟。選定最佳緩沖液后，配置其不同pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0），重復(fù)檢測(cè)步驟。

2）研究掃描速度的影響 注射泵的兩個(gè)進(jìn)樣器分別吸取B-R緩沖液（pH 3.0）和500μmol/L的沒食子酸溶液2 mL，設(shè)定其進(jìn)料流量為40μL/min，改變循環(huán)伏安掃描方式，同一條件下連續(xù)檢測(cè)5次，取氧化峰電流的平均值。

3）研究進(jìn)料速度的影響 注射泵的兩個(gè)進(jìn)樣器分別吸取B-R緩沖液（pH 3.0）和500μmol/L的沒食子酸溶液2 mL，設(shè)定循環(huán)伏安掃描速度為100 mV/s，改 變 進(jìn) 料 流 量（0，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200μL/min），同一條件下連續(xù)檢測(cè)5次，取氧化峰電流的平均值。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，分別測(cè)定5～1 250μmol/L共13組不同濃度沒食子酸的氧化峰電流值，同一濃度下連續(xù)檢測(cè)5次，取氧化峰電流的平均值，每次檢測(cè)所消耗的沒食子酸溶液為10μL。以沒食子酸濃度x為橫坐標(biāo)，氧化峰電流值y為縱坐標(biāo)，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.6 普洱茶樣品中的茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定取普洱茶樣品母液0.25 mL加至100 mL容量瓶中，加水定容，取4份5 mL樣品溶液，分別加入一定量的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，得到樣品待測(cè)液，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，分別測(cè)定其氧化峰電流，平行檢測(cè)3次，計(jì)算得到回收率與樣品中茶多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)分析方法采用Excel 2013記錄和整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用OriginPro 2017軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 沒食子酸在微流控檢測(cè)平臺(tái)上的電化學(xué)行為

圖3為空白底液和沒食子酸溶液在集成不同活化電極的微流控檢測(cè)平臺(tái)上的循環(huán)伏安圖（電壓0～0.9 V）。兩種活化電極在空白底液中，未出現(xiàn)電流響應(yīng)；在沒食子酸溶液中，電壓在0.41 V（相對(duì)于Ag/AgCl）左右均出現(xiàn)一個(gè)不可逆的氧化峰，與文獻(xiàn)[17]中報(bào)道的一致。對(duì)比圖3中（a）和（b）兩條曲線可知，飽和碳酸鈉活化電極的氧化峰電流響應(yīng)更大，峰形明顯，主要原因是經(jīng)過飽和碳酸鈉溶液處理后，電極表面的碳墨變得蓬松多孔，增加了其與沒食子酸的接觸面積；同時(shí)，電極表面生成的含氧基團(tuán)有利于減弱羥基鍵能[18]。這些性質(zhì)有效提高了電極表面的電荷遷移速度，使得電極反應(yīng)速度加快，故選擇在微流控檢測(cè)平臺(tái)上集成飽和碳酸鈉活化電極。

圖3 飽和碳酸鈉活化電極和稀硫酸活化電極的循環(huán)伏安圖Fig.3 CVs of saturated sodium carbonate solution activated carbon electrodes and dilute sulfuric acid solution activated carbon electrodes

2.2 緩沖液種類和pH的影響

沒食子酸的電化學(xué)行為與緩沖液種類和pH等多種因素有關(guān)。在微流控檢測(cè)平臺(tái)上，采用循環(huán)伏安法對(duì)B-R，PBS和CBS 3種緩沖液中沒食子酸的氧化行為進(jìn)行研究。由圖4（a）可知，B-R緩沖液的氧化峰與陽極電流分離較好，峰電流最大，因此選擇B-R緩沖液作為支持電解質(zhì)。

通過循環(huán)伏安法在pH 2.0～8.0范圍內(nèi)研究BR緩沖液的pH對(duì)沒食子酸氧化峰電流的影響。由圖4（b）可知，當(dāng)pH增加時(shí)，沒食子酸的氧化峰電位負(fù)向移動(dòng)，表明質(zhì)子參與電極反應(yīng)[19]。氧化峰電位與理論值[17]接近。由圖4（c）可知，在pH 2.0～8.0范圍內(nèi)，沒食子酸的氧化峰電流隨著pH的增加先增后減，在pH約為3.0處獲得最大的峰電流響應(yīng)。因此，作者選擇pH為3.0的B-R緩沖液，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖4 緩沖液種類和pH對(duì)沒食子酸氧化峰電壓和峰電流的影響Fig.4 Effect of buffer types and pH on the oxidation peak potential and peak current of GA

2.3 掃描速度的影響

圖5是不同掃描速度對(duì)沒食子酸氧化峰電流的影響。由圖5（a）可知，氧化峰電流隨著掃描速度的增大而增大。由圖5（b）可知，氧化峰電流與掃描速度的平方根具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Ipa=3.820 2+0.234 5v1/2，這表明電極反應(yīng)過程受擴(kuò)散控制[20]。掃描速度超過100 mV/s時(shí)，循環(huán)伏安曲線逐漸毛糙，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾和誤差，綜合考慮氧化峰電流大小和循環(huán)伏安曲線的光滑程度，掃描速度選擇100 mV/s為佳。

圖5 掃描速度對(duì)沒食子酸氧化峰電流的影響Fig.5 Effect of scan rates on the oxidation peak current of GA

2.4 進(jìn)料流量的影響

圖6為不同進(jìn)料流量對(duì)氧化峰電流的影響。進(jìn)料流量分別在0和20μL/min時(shí)，連續(xù)5次測(cè)得的氧化峰電流相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD大于10%，重復(fù)性較差，分析其原因可能是微流控芯片中的液體流速過慢時(shí)，芯片內(nèi)部液體分布不均勻，導(dǎo)致芯片電化學(xué)檢測(cè)區(qū)的沒食子酸濃度產(chǎn)生波動(dòng)，影響了檢測(cè)重復(fù)性；進(jìn)料流量在40～200μL/min時(shí)，氧化峰電流隨著進(jìn)料速度的增加先減小后增加，最后趨于穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較好（RSD小于1.7%），分析其原因可能是隨著進(jìn)料速度的增加，芯片內(nèi)部流場(chǎng)逐漸穩(wěn)定，但部分沒食子酸的氧化產(chǎn)物吸附在工作電極表面，阻礙了電荷轉(zhuǎn)移，降低了電極表面的反應(yīng)速率[21]；隨著進(jìn)料流量進(jìn)一步增加，沒食子酸在電極表面的更新速度加快，使得電極反應(yīng)速度增加，當(dāng)沒食子酸的更新速度達(dá)到極限時(shí)，氧化峰電流逐漸穩(wěn)定。綜合考慮氧化峰電流、重復(fù)性和試劑用量，選擇流量為40μL/min。

圖6 氧化峰電流與進(jìn)料流量的關(guān)系Fig.6 Plots of the oxidation peak current for GA as function of inject speeds

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，采用微流控檢測(cè)平臺(tái)對(duì)不同濃度的沒食子酸進(jìn)行循環(huán)伏安檢測(cè)。圖7（A）為不同 濃 度（5，10，25，50，75，100，200，300，400，500，750，1 000，1 250μmol/L）沒食子酸的循環(huán)伏安圖，由圖7（a）可知，氧化峰電流隨著沒食子酸濃度的增加而增加。由圖7（b）可知，沒食子酸濃度在5～1 250μmol/L范圍內(nèi)與氧化峰電流有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Ipa=0.174 3+0.011 4c（Ipa，μA；c，μmol/L；R2=0.998 0），最低檢出限為6.9×10-7mol/L（S/N=3），靈敏度為0.011 4μA/（μmol/L）。

2.6 重現(xiàn)性、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)微流控檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行了重現(xiàn)性、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性的研究。在微流控檢測(cè)平臺(tái)上連續(xù)檢測(cè)500μmol/L的沒食子酸溶液5次，測(cè)得氧化峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.739%，說明檢測(cè)平臺(tái)具有良好的重現(xiàn)性。采用飽和碳酸鈉溶液活化5片新的絲網(wǎng)印刷碳電極，并依次集成到微流控檢測(cè)平臺(tái)中對(duì)500μmol/L的沒食子酸溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得氧化峰電流的RSD為2.231%，說明檢測(cè)平臺(tái)具有良好的再現(xiàn)性。采用同一微流控檢測(cè)平臺(tái)連續(xù)一周對(duì)500μmol/L的沒食子酸溶液進(jìn)行檢測(cè)（測(cè)量次數(shù)大于50次），測(cè)得氧化峰電流的RSD為2.068%，說明檢測(cè)平臺(tái)具有良好的穩(wěn)定性。

圖7 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定Fig.7 Determination of GA standard curve

2.7 樣品分析

取4份已制備的普洱茶樣品待測(cè)液，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定其氧化峰電流，平行檢測(cè)3次取平均值。樣品檢測(cè)結(jié)果如表1所示，回收率在97.6%～104.6%之間，與福林酚法的檢測(cè)結(jié)果基本一致，表明本方法可滿足茶多酚常規(guī)分析要求。

3 結(jié)語

將茶多酚檢測(cè)過程中的進(jìn)料、混合和循環(huán)伏安檢測(cè)功能集成在微流控芯片上，并設(shè)計(jì)了可集成絲網(wǎng)印刷碳電極的插口，降低了微電極的制作成本，采用3D打印技術(shù)制造微流控芯片，建立了微流控檢測(cè)平臺(tái)。

通過實(shí)驗(yàn)對(duì)緩沖液種類、緩沖液pH、掃描速度和進(jìn)料速度4個(gè)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并運(yùn)用該方法測(cè)定普洱茶樣品中茶多酚的含量，檢測(cè)結(jié)果與福林酚法基本一致，滿足茶多酚的常規(guī)分析要求。

本方法中進(jìn)樣、混合和循環(huán)伏安檢測(cè)過程自動(dòng)化進(jìn)行，省去了人工操作環(huán)節(jié)，檢測(cè)時(shí)間縮短為40 s，試劑用量為70μL，具有簡(jiǎn)便、低成本、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于茶多酚含量的快速檢測(cè)，并可推廣到其他植物提取物的快速檢測(cè)。