何桂華，韓煥美，*，鄭新華，張愛霞，陳晞，王樂，耿巖玲，王曉，段文娟，趙恒強(qiáng)（.濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濟(jì)南5004；.山東省分析測試中心，山東濟(jì)南5004）

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人工合成色素偶氮玉紅標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制

何桂華1，韓煥美1，*，鄭新華1，張愛霞1，陳晞1，王樂1，耿巖玲2，王曉2，段文娟2，趙恒強(qiáng)2
（1.濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濟(jì)南250014；2.山東省分析測試中心，山東濟(jì)南250014）

摘要：建立了一種快速有效的制備食用合成色素偶氮玉紅標(biāo)準(zhǔn)樣品的方法。采用凝膠色譜技術(shù)對篩選的偶氮玉紅原料純化后，再用無水乙醇對產(chǎn)物進(jìn)行沉降、洗滌，室溫真空干燥，粉碎，過篩，可得偶氮玉紅純品；然后通過核磁共振（1HNMR譜、(13)CNMR譜）、紅外光譜、LC-MS/MS法對樣品進(jìn)行定性分析，結(jié)構(gòu)確認(rèn)后進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)；經(jīng)8家具有資質(zhì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同定值，偶氮玉紅純度為99.23%±0.38%，滿足標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求。

關(guān)鍵詞：偶氮玉紅；標(biāo)準(zhǔn)樣品；合成色素

偶氮玉紅，又稱酸性紅（Azorubine），是通過重氮化4-氨基萘磺酸和4-羥基萘磺酸之間的偶合反應(yīng)，利用現(xiàn)代的生物技術(shù)制成的食用合成色素。偶氮玉紅是一種偶氮型酸性染料，外觀為紅色粉末或顆粒，溶于水，微溶于乙醇，具有酸性染料的特性，而且具有耐熱性、耐堿性、耐氧化還原性和良好的染色性。偶氮玉紅，因?yàn)榫哂泻铣芍珓┑墓残裕热缟珴甚r艷、著色力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉，成為食品工業(yè)常用的添加劑之一。但是，由于偶氮玉紅是以萘等芳烴類化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過磺化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)化合而成[1]，屬于苯胺類色素。研究表明，苯胺類色素影響人體細(xì)胞代謝﹑酶的活力，甚至在人體內(nèi)形成致癌物，引起癌變，過量食用對人體健康危害極大[2]。GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了各類食品中各種著色劑的使用限量，其中偶氮玉紅為0.05 g/kg[3]而且僅限于冷凍飲品、糖果劑焙烤食品掛漿，因此，合成著色劑的檢測已成為食品安全質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。在常規(guī)檢測工作中，標(biāo)準(zhǔn)樣品是具有一種或多種足夠均勻的和很好確定了的特性值的材料和物質(zhì)，可以用來校準(zhǔn)儀器、評價(jià)測量方法和給材料賦值，是產(chǎn)品質(zhì)量控制和保證結(jié)果準(zhǔn)確度的重要溯源標(biāo)準(zhǔn)[4-6]。目前，我國多種合成著色劑包括偶氮玉紅還沒有標(biāo)準(zhǔn)樣品，均是依靠國外進(jìn)口，費(fèi)時(shí)費(fèi)力不經(jīng)濟(jì)。本文報(bào)道了偶氮玉紅標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制方法，對完善我國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體系建設(shè)、加強(qiáng)食品安全質(zhì)量控制具有重要意義。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

Agilent1260液相色譜儀配二極管陣列檢測器：美國安捷倫公司；TSQ quantum ultra液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Thermo公司；Bruker AV400核磁共振儀：德國Bruker公司；Shimadzu UV-3100紫外-可見光譜分光光度計(jì)：德國賀利氏公司；傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀：德國Bruker公司；感量為0.1 mg的分析天平：瑞士梅特勒公司；Milli-Q純水器：美國Millipore公司；IKAKS130型振蕩器：德國IK公司。

甲醇和乙腈（色譜純）：默克公司；無水乙醇（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水由Milli-Q純水器制備；偶氮玉紅85（又名酸性紅，CAS：3567-69-9，分子式：C20H12N2Na2O7S2，分子量：502.44）：購于上海染料研究所。其他試劑，如非提及均為分析純。

1.2試驗(yàn)條件

用硅膠裝填凝膠色譜柱（容量800 mL），以水沖洗凝膠色譜柱備用；稱取偶氮玉紅粗品2.0 g，溶于30 mL水中，超聲溶解，加入助濾劑硅藻土，攪拌15 min后過濾，濾液加入凝膠柱，用純水沖洗凝膠柱，前期分出少許副色素，收集主色素組分，減壓蒸出水分，溶液濃縮至約20 mL，過濾，濾液加入無水乙醇10 mL，產(chǎn)物沉降，再次過濾，以無水乙醇洗滌，室溫真空干燥，粉碎，過60目篩，得偶氮玉紅純品（99.5 %）。

1.3色譜條件

色譜柱：Agela Technologies Venusil XBP-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，150魡）或相當(dāng)者；流動相A：20 mmol/L乙酸銨；流動相B：甲醇；流動相采用梯度洗脫，洗脫條件見表1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：520 nm。

表1　液相色譜流動相洗脫梯度條件Table 1 Condition of mobile phase for purifying carmosine by HPLC

1.4定性分析

LC-MS/MS的色譜條件：偶氮玉紅樣品用甲醇溶解，濃度為1.0 μg/mL；色譜柱：Thermo Hypersil GOLD （2.1 mm×100 mm）；流動相：20 mmol/L乙酸銨水溶液+甲醇，梯度根據(jù)色譜柱和表1適當(dāng)調(diào)整；流速為0.3 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣量5 μL。LC-MS/MS操作條件：ESI源負(fù)離子MRM監(jiān)測模式；霧化氣是氮?dú)?，壓?.525 kPa；毛細(xì)管電壓：4 000 V；干燥氣溫度：300℃；流速：8 L/min；源內(nèi)裂解電壓：175 V；碰撞能量：-35 V；去簇電壓：-60 V；掃描范圍：m/z 250-800。

偶氮玉紅的1HNMR和13CNMR的譜圖均是在Bruker AV400上完成，溶劑是氘代二甲亞砜；傅立葉變換紅外光譜在Bruker V80光譜儀上完成，樣品以KBr樣品壓片后直接黏附在樣品架上，每個(gè)譜圖掃描32次，分辨率為4 cm-1，背景譜圖是空氣，紅外光譜采用透射模式；紫外-可見光譜用Shimadzu UV-3100 UV-VIS-NIR分光光度計(jì)測定，將制備好的偶氮玉紅純品配制成濃度為20 μg/mL的水溶液，用紫外可見光譜進(jìn)行全波長掃描。

2　結(jié)果與分析

2.1純化條件選擇

偶氮玉紅粉末用8 %氯化鈉水溶液與95 %乙醇組成的混合溶劑（3∶2，體積比）重結(jié)晶二次，再以10 %乙酸鉀水溶液與95 %乙醇組成的混合溶劑（2∶1，體積比）重結(jié)晶二次，最后再以約40℃的95 %乙醇對偶氮玉紅濾餅洗滌二次，濾餅于80℃烘干，粉碎，過60目篩，得干劑純度為98.7 %，產(chǎn)率最高僅為72.3 %。雖然重結(jié)晶方法采用試劑較為單純，但是該方法耗時(shí)長，產(chǎn)率低，不經(jīng)濟(jì)。

偶氮玉紅經(jīng)凝膠色譜預(yù)分析后了解，原料主要雜質(zhì)為分子量較小的未磺化芳族伯胺和未反應(yīng)原料以及少許分子量較大的副色素，故可以采用凝膠色譜法分離?？紤]到偶氮玉紅的理化性質(zhì)，凝膠色譜采用水作為洗脫溶劑；有考慮到分子量較小的且極性相對較大的雜質(zhì)對目標(biāo)物的干擾，加入一定量的助濾劑硅藻土。收集目標(biāo)產(chǎn)物洗脫液，減壓蒸出部分，使得未完全分離、分子量較大的副色素結(jié)晶或沉淀以便過濾除去，濾液中加入適量無水乙醇，偶氮玉紅產(chǎn)物沉淀，再次過濾并用無水乙醇洗滌后，可以得到純度較高的偶氮玉紅產(chǎn)品，產(chǎn)率還比較可觀。經(jīng)室溫干燥、粉碎、過篩后，采用HPLC法對其純度進(jìn)行驗(yàn)證，純度為99.5 %，滿足標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求。偶氮玉紅，若是通過均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)，再經(jīng)多家實(shí)驗(yàn)室定值，應(yīng)該可以作為實(shí)驗(yàn)室在日常檢測中的對照品或標(biāo)準(zhǔn)品使用。

2.2定性分析

對制備的純品通過核磁共振、紅外光譜和液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行定性分析。分析偶氮玉紅1HNMR數(shù)據(jù)如下：δ8.10（1H，s）、7.56（1H，t）、9.00（-OH，d）、8.68 （1H，d）、8.03（1H，s）、8.46（1H，t）、7.80（1H，t）、7.70 （1H，t）；其13CNMR數(shù)據(jù)如下：133.54、120.95、125.15、 122.19、125.45、112.26、131.55、126.01、126.01、133.23、144.31、126.69、130.37、128.95、128.81、133.54；紅外光譜的特征吸收峰：3 435、1 604、1 500、1 474、1 435、1409、1277、1191、1046、1002、762、687、654、625、595cm-1，與報(bào)道和有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定工具書涉及內(nèi)容[7]吻合良好；分析偶氮玉紅的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜的總離子流圖和一級質(zhì)譜圖（圖1），可知，出峰時(shí)間約12 min，掃出質(zhì)荷比為456.92的[M-2Na+H]-離子峰和479.18的 [M-Na]-離子峰。核磁共振成像、紅外光譜、質(zhì)譜之間結(jié)果既獨(dú)立又能相互印證，與文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]的偶氮玉紅的結(jié)構(gòu)信息吻合，證明樣品是偶氮玉紅。

圖1　偶氮玉紅液相色譜質(zhì)譜總離子流圖（A）和一級質(zhì)譜圖（B）Fig.1 Total ion chromatogram（A）and mass spectra（B）of carmosine

2.3均勻性與穩(wěn)定性檢驗(yàn)

2.3.1均勻性檢驗(yàn)

采用隨機(jī)順序重復(fù)測量方法，從分裝后的樣品中隨機(jī)抽取10瓶樣品，按3種程序分別從每瓶中稱取1.0 mg樣品3份，每份樣品分別用10.0 mL去離子水溶解，進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算其純度。采用方差分析法進(jìn)行檢驗(yàn)，對其均勻性做出判斷。表2為均勻性檢驗(yàn)的測量數(shù)據(jù)。

表2　均勻性檢驗(yàn)的測量數(shù)據(jù)Table 2 Data measured for homogeneity test of carmosine

續(xù)表2均勻性檢驗(yàn)的測量數(shù)據(jù)Continue table 2 Data measured for homogeneity test of carmosine

對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和F檢驗(yàn)，查F界值表，得F0.05(9，20)=2.94，由于F= MSamong/MSwithin=1.62＜F0.05(9，20)，所以本樣品是均勻的。

2.3.2穩(wěn)定性檢驗(yàn)

樣品分裝后，于室溫下干燥避光密閉保存。以24個(gè)月為期對制備的偶氮玉紅標(biāo)準(zhǔn)樣品每6個(gè)月取樣檢驗(yàn)，每份試樣以測定5次的平均值為其測量結(jié)果，以其數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)做散點(diǎn)圖，觀察因變量（純度）與自變量（月份）是否具有線性關(guān)系。從散點(diǎn)圖（圖2）可以看出，0～24個(gè)月的純度值與其時(shí)間存在明顯的線性關(guān)系，故采用直線作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^觀察斜率值是否有顯著變化對標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測，用t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析斜率，斜率變化不顯著，說明偶氮玉紅標(biāo)準(zhǔn)樣品在兩年內(nèi)未觀測到顯著的不穩(wěn)定性。

圖2　偶氮玉紅穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果的散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter diagram of carmosine for satability testing.

2.4標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值

經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全掃描后發(fā)現(xiàn)偶氮玉紅在波長285、330、520 nm處有特征吸收，其中520 nm吸收值最強(qiáng)，而且此波長下干擾物質(zhì)最少，因此，HPLC定值分析選擇520 nm，其色譜圖見圖3。

圖3　偶氮玉紅的液相色譜圖Fig.3 Chromatogram of carmosine by HPLC

按照GB/T 15000.3-2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》標(biāo)準(zhǔn)要求，采用8家獲得國家認(rèn)可、具備資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值。隨機(jī)抽取48瓶樣品，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室6瓶，按照上述HPLC條件應(yīng)用面積歸一法進(jìn)行定值，圖2為偶氮玉紅的典型液相色譜圖，表3為8家實(shí)驗(yàn)室對偶氮玉紅樣品的定值結(jié)果匯總。

用格拉布斯（Grubbs）檢驗(yàn)法對8家實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，剔除可疑值后計(jì)算其平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。偶氮玉紅標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果為：標(biāo)準(zhǔn)值：99.23 %；置信度為95 %的擴(kuò)展不確定度值：0.38 %；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差Sr：0.06 %；實(shí)驗(yàn)室間標(biāo)準(zhǔn)偏差SL：0.09 %。

表3　定值結(jié)果匯總表Table 3 Multi-lab certification result collected in one table

3　結(jié)論

采用凝膠色譜技術(shù)對市售偶氮玉紅原料純化，制得偶氮玉紅純品。通過核磁共振（1HNMR譜、13CNMR譜）、紅外光譜和LC-MS/MS對偶氮玉紅純品進(jìn)行定性分析，8家實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用HPLC法進(jìn)行協(xié)同定值，偶氮玉紅純度為（99.23±0.38）%，滿足標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求，為產(chǎn)品質(zhì)量控制、檢測方法驗(yàn)證和保證實(shí)驗(yàn)室測量結(jié)果的準(zhǔn)確可靠與互認(rèn)建立了溯源標(biāo)準(zhǔn)，對完善我國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體系建設(shè)具有重要意義。

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Preparation and Certification of Reference Sample Carmosine Derived from Synthetic Colorant

HE Gui-hua1，HAN Huan-mei1，*，ZHENG Xin-hua1，ZHANG Ai-xia1，CHEN Xi1，WANG Le1，GENG Yan-ling2，WANG Xiao2，DUAN Wen-juan2，ZHAO Heng-qiang2
（1. Jinan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Jinan 250014，Shandong，China；2. Shandong Analysis and Test Center，Jinan 250014，Shandong，China）

Abstract：A methodology regarding the preparation and certification of certified reference sample of carmosine was presented．Carmosine on sale was purified by gel chromatography technology，and then the collection was precipitated and washed with alcohol. The production was processed with vacuum drying at room temperature，mashing and sieving continuously to be pure sample. After the qualitative analysis of carmosine by1HNMR spectrum and(13)CNMR spectrum，infrared spectrum and LC-MS/MS，homogeneity test and stability testing were employed. And then，the purity was certified by HPLC in different 8 qualified laboratories，the result analyzed statistically was 99.23 %±0.38 %．

Key words：carmosine；standard sample；synthetic colorant

收稿日期：2015-02-02

*通信作者

作者簡介：何桂華（1968—），女（漢），高級工程師，碩士，主要從事食品檢驗(yàn)研究。

基金項(xiàng)目：國家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目（2012IK178）；山東局科研項(xiàng)目（SK201424）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.034