周玉川　劉康　鐘立明　楊巧麗　游箭　魏欣　鄧川

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院　1.組織工程與干細(xì)胞研究所；2.介入放射科， 四川 南充 637000)

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·論著·

醫(yī)用臭氧對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)研究*

周玉川1劉康1鐘立明2楊巧麗2游箭2魏欣2鄧川2

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院1.組織工程與干細(xì)胞研究所；2.介入放射科， 四川 南充 637000)

【摘要】目的探討使用醫(yī)用臭氧(O3)在體外對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的作用。 方法獲取人肝癌HepG2細(xì)胞在體外增殖、傳代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組采用含濃度為0.5μg/ml的醫(yī)用臭氧水的培養(yǎng)液處理細(xì)胞，對(duì)比兩組試驗(yàn)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞凋亡情況、細(xì)胞遷移能力變化。結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，含臭氧的培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)量明顯減少，腫瘤細(xì)胞膜破裂，核固縮甚至裂解，臭氧對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，同時(shí)CCK-8的檢測(cè)結(jié)果顯示O3能抑制肝癌細(xì)胞的增殖(P<0.01)，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示O3能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移(P<0.01)。結(jié)論臭氧能直接殺死肝癌HepG2細(xì)胞，能在體外抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和遷移。

【關(guān)鍵詞】臭氧；肝癌HepG2細(xì)胞；抑制作用；殺傷

肝癌是全球惡性程度極高、預(yù)后極差的惡性腫瘤之一。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多步驟的復(fù)雜的過(guò)程[1]，傳統(tǒng)治療肝癌的手段主要有手術(shù)治療、放療和化療等，隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的不斷發(fā)展，人類對(duì)惡性腫瘤的生物學(xué)特性及其治療方式研究的不斷深入，聯(lián)合運(yùn)用多種綜合治療方式已被大多數(shù)學(xué)者所接受。近年來(lái)，對(duì)于臭氧(O3)是否能夠治療惡性腫瘤仍存在懷疑，關(guān)于O3的療效報(bào)道不一[2]。國(guó)內(nèi)外有關(guān)單獨(dú)應(yīng)用O3治療惡性腫瘤的報(bào)道極少，O3發(fā)揮腫瘤治療作用的機(jī)制尚不清楚。本研究擬采用一定的醫(yī)用O3濃度作用于體外培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)影響，探討O3應(yīng)用于臨床治療腫瘤的可行性，同時(shí)為O3治療惡性腫瘤的體外實(shí)驗(yàn)提供可行的實(shí)驗(yàn)方案，為后續(xù)的研究提供重要的研究方法和數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1材料和主要試劑人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自ATCC；O3由南充市中心醫(yī)院介入科臭氧發(fā)生儀(Medozon，德國(guó)赫爾曼)制得；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本DOJINDO公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、Matrigel基質(zhì)膠和基質(zhì)膜購(gòu)自BD公司；CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)購(gòu)自Thermo Fisher公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自上?？迫A公司；電子熒光顯微鏡購(gòu)自日本NIKON；DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone, Thermo scientific)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞快速?gòu)?fù)蘇后，接種于T75的培養(yǎng)瓶中，加10ml含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基，混勻后置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，向48孔板中加入5×104個(gè)/孔的細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入含臭氧0.5μg/ml的10%胎牛血清的培養(yǎng)液500μl，對(duì)照組加入等量的含血清培養(yǎng)基。24h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，瑞氏染液染色，拍照。

1.2.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定將1個(gè)48孔板分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入含臭氧0.5μg/ml培養(yǎng)液600μl，對(duì)照組加入等量的含血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7天，每天取3孔用牛鮑氏計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取每日均數(shù)作圖，即為細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4CCK-8檢測(cè)O3對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)0.25% 胰酶消化后制成6×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。向48孔培養(yǎng)板中加入100μl/孔細(xì)胞混懸液。將細(xì)胞分為2組，分別是濃度為0.5μg/ml的O3實(shí)驗(yàn)組和未處理的空白對(duì)照組，復(fù)孔數(shù)為5。待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組中添加含臭氧0.5μg/ml的含血清培養(yǎng)液500μl，空白對(duì)照組添加含血清培養(yǎng)液500μl。各組細(xì)胞處理24 h 后每孔加入10μl CCK-8，37℃孵育4h。4h后，吸取上清液200μl于96孔板中，在波長(zhǎng)450nm處測(cè)吸光度值并記錄。

1.2.5Transwell遷移實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞 分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組加含血清培養(yǎng)液預(yù)處理8h，實(shí)驗(yàn)組用含O30.5μg/ml的含血清培養(yǎng)液預(yù)處理8h，然后換為無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理4h后消化細(xì)胞，每組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)培養(yǎng)小室上室內(nèi)加入200μl細(xì)胞懸液(5×104個(gè)細(xì)胞)。培養(yǎng)小室下加入600μl 含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。將膜用PBS洗2次 ，用棉簽輕輕擦拭上室內(nèi)側(cè)面的細(xì)胞，用福爾馬林液固定30 min，洗2次，0.1%結(jié)晶紫染色，室溫30min，然后用PBS液清洗3次，倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用t檢驗(yàn)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察腫瘤細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，在培養(yǎng)24h后細(xì)胞生長(zhǎng)狀況(如圖1)，可以看到對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，染色結(jié)果顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞漿豐富，核均勻分布。而O3組細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，細(xì)胞邊緣模糊，胞漿減少，細(xì)胞膜破裂，核固縮甚至裂解。

圖1對(duì)照組(a,b,c)和實(shí)驗(yàn)組(d,e,f)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)比

Fig1Morphology of control group and experiment group

注：b,c,e,f采用瑞氏染色；a,c,d,f(×200);b,e(×100)

2.2腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線空白對(duì)照組種植在48孔板中第1天，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，第1～4天細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，第4～6天細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，第6～7天細(xì)胞出現(xiàn)衰老死亡。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在培養(yǎng)的第1天細(xì)胞總數(shù)顯著減少，第2～5天細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)，第5～6天出現(xiàn)較快生長(zhǎng)，第6～7天趨于穩(wěn)定，見圖2。

2.3O3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響在細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后采用CCK-8檢測(cè)各孔的吸光度值，以空白組做對(duì)照，測(cè)得各組 OD 值(見圖3)，運(yùn)用T檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組做分析，結(jié)果表明O3對(duì)肝癌細(xì)胞的增值有抑制作用，結(jié)果有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) 。

圖2實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Figure 2The growth curve of experiment group and control group

2.4Transwell遷移實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)臭氧處理的實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸脂膜的細(xì)胞數(shù)量明顯低于空白對(duì)照組(見圖4)，經(jīng)T檢驗(yàn)計(jì)算差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3臭氧對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響.

Figure 3The effect of ozone solution on proliferation of liver cancer cell HepG2

注： 與對(duì)照組比較，①P<0.01

圖4對(duì)照組(a)與實(shí)驗(yàn)組(b)O3對(duì)HepG2 細(xì)胞遷移的影響

Figure 4The effect of ozone solution on migration of liver cancer cell HepG2

注：結(jié)晶紫染色(×200)；兩組比較P<0.01

3討論

O3水具有極強(qiáng)的氧化性，是廣譜的殺菌劑。但臭氧的化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，在空氣和水中會(huì)分解變成氧氣和氧自由基，O3變成氧氣的解離速度取決于溫度，pH值，水質(zhì)[3]。本次實(shí)驗(yàn)采用的醫(yī)用臭氧水都是在按臨床治療標(biāo)準(zhǔn)配置而成，雙蒸水高壓滅菌后，測(cè)得pH值為7.0，在20℃制得含臭氧0.5μg/ml的培養(yǎng)液。從制得的臭氧濃度的培養(yǎng)基到加樣完成控制在20min以內(nèi)，操作過(guò)程中減少避免劇烈震蕩，盡量減少實(shí)驗(yàn)前O3的消耗，并在無(wú)菌室溫環(huán)境下培養(yǎng)10min，充分保證O3與培養(yǎng)細(xì)胞的反應(yīng)時(shí)間和濃度，然后放入37℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

據(jù)Bhalla D.K[4]研究，臭氧能損傷人體的呼吸道黏膜，甚至能導(dǎo)致肺部炎癥，此外無(wú)報(bào)道對(duì)人體其他組織有影響，實(shí)驗(yàn)人員在操作過(guò)程中盡量減少與臭氧的直接接觸，帶好口罩，手套，在安全柜中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

有大量報(bào)道O3用于各種疾病的治療，主要利用O3的強(qiáng)氧化性、抗炎、鎮(zhèn)痛以及殺菌的作用[5～9]。最新報(bào)道[10]稱臭氧還能用于緩解肌肉疲勞，改善心功能。自從利用O3的自血療法[11]治療腫瘤并取得療效后，已有相關(guān)研究報(bào)道其在體內(nèi)抗腫瘤的作用機(jī)制，如增強(qiáng)紅細(xì)胞的代謝，改善局部血液循環(huán)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的免疫細(xì)胞因子[12]。有報(bào)道體外O3對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用[13]，但O3對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用機(jī)制尚不明確。就本實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，還沒(méi)有任何O3在體外單獨(dú)抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖的報(bào)道。

Huz JI等[14]的報(bào)道低氧環(huán)境能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)理是O3在水溶液中能逐漸分解產(chǎn)生氧氣，造成一個(gè)持續(xù)的富氧環(huán)境，抑制腫瘤組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)。Sweet等[15]將人工培養(yǎng)的肺癌、乳腺癌及子宮癌細(xì)胞暴露在空氣中，并且分別施加不同濃度的O3于密閉的空氣中，觀察不同濃度的O3對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常組織細(xì)胞的影響，當(dāng)O3濃度達(dá)到0.3～0.5μg/m1能抑制40-60%腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而非腫瘤細(xì)胞并沒(méi)有明顯損傷；當(dāng)空氣中的O3濃度達(dá)0.8μg/m1，90%的腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)受到抑制，非腫瘤細(xì)胞的損傷達(dá)到50%，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示O3濃度控制在一定范圍內(nèi)可以選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞。而本次實(shí)驗(yàn)的濃度為0.5μg/m1，正是基于該報(bào)道，事實(shí)證明，在該濃度下，腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用明顯，與上述報(bào)道相符。還有研究[16]顯示O3與化療藥物聯(lián)合使用能提高5-Fu療效。

癌細(xì)胞最主要的生物學(xué)特征是能持續(xù)的分裂和增殖，因此抑制腫瘤細(xì)胞的分裂增殖，甚至能誘導(dǎo)其凋亡是腫瘤治療的重要手段之一[17]。本次實(shí)驗(yàn)選用形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)曲線、CCK-8 法和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)對(duì)O3的增殖抑制作用進(jìn)行檢測(cè)，獲得了O3抑制肝癌細(xì)胞增殖的體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。首先通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致胞漿漏出，進(jìn)而胞膜褶皺，呈毛細(xì)胞樣，最后出現(xiàn)裸核。而細(xì)胞核的變化跟細(xì)胞凋亡一樣，先是核固縮，最后細(xì)胞核裂解[18]。這與Kuroda K1[19]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，與臭氧直接接觸的腫瘤細(xì)胞都發(fā)生了壞死，但這與Costanzo[20]的研究結(jié)論不同，可能與實(shí)驗(yàn)方法有關(guān)。特別是兩者之間的濃度差異和處理方式不同有關(guān)。因此，臭氧是否能激發(fā)細(xì)胞凋亡的通路還是因?yàn)槔砘再|(zhì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解還不得而知，這需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)去研究。

實(shí)驗(yàn)繪制的生長(zhǎng)曲線和CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖中，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞因?yàn)椴糠直恢苯託⑺?，部分?xì)胞形態(tài)受到影響，因此生長(zhǎng)曲線檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程出現(xiàn)最初的細(xì)胞數(shù)量減少，然而隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，O3被分解，變成O2不溶于水而揮發(fā)，對(duì)細(xì)胞的作用減少甚至消失，一段時(shí)間后腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)增長(zhǎng)。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，因細(xì)胞死亡和結(jié)構(gòu)的變化，實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)聚碳酸脂膜的細(xì)胞數(shù)量較空白對(duì)照組顯著減少。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)顯示，醫(yī)用臭氧水在體外條件下能夠直接強(qiáng)力殺傷腫瘤細(xì)胞，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但作用機(jī)制尚待深入研究。提示臭氧有望更多的用于腫瘤患者的康復(fù)與治療。后續(xù)研究將觀察臭氧對(duì)肝癌家兔體內(nèi)的療效。并從形態(tài)學(xué)入手，逐步探索臭氧治療腫瘤的機(jī)理。

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Research for the treatment of medical ozone on liver cancer cell line HepG2

ZHOU Yuchuan1,LIU Kang1,ZHONG Liming2,et al

(1.ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCells·TheSecondClinicalMedicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China；2.DepartmentofInterventionalMedicinc,NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the inhibitory effect of medical ozone on liver cancer cell line HepG2 in vitro. MethodsThe liver cancer cell line HepG2 were divided into experiment group and control group. The experiment group was treated with 0.5μg/ml medical ozone. The morphology, growth curve, apoptosis and migration ability were observed. ResultsThe cells in experiment group were decreased compared with that of control group. There were cell membrane breakage, karyopycnosis and even nuclear cracked in experiment group. Transwell model Assay showed tumor cells migration was inhibited by ozone solution. ConclusionOzone can restrain proliferation and migration of liver cancer cell line HepG2, and can directly kill HepG2 liver cancer cells in vitro.

【Key words】Ozone; Liver cancer cell line HepG2; Inhibition; Kill

(收稿日期：2015-11-02； 編輯： 陳舟貴)

【中圖分類號(hào)】R 735.7

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.04.006

通訊作者：鐘立明，主任醫(yī)師，教授，電話：13696235751

基金項(xiàng)目：南充市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目(13A0047)