葉　婕， 尹麗梅， 葉慶生

(華南師范大學生命科學學院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣州 510631)

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金釵石斛花芽蛋白質(zhì)提取及其雙向電泳體系優(yōu)化

葉婕， 尹麗梅， 葉慶生*

(華南師范大學生命科學學院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣州 510631)

摘要：通過對蛋白質(zhì)提取方法、水化方式、等點聚焦程序、IPG膠條選擇等方面的優(yōu)化，建立金釵石斛花芽蛋白質(zhì)雙向電泳體系.結(jié)果表明，采用酚抽提法提取蛋白，樣品與水化液1∶40復(fù)溶；被動水化，等點聚焦程序B2；選用24 cm pH 3～10NL 膠條和12% 的凝膠；采用考馬斯亮藍G-250染色，獲得了可識別1 422個蛋白質(zhì)斑點的雙向電泳圖譜，且重復(fù)性好、分辨率高，為進一步開展金釵石斛花芽在蛋白質(zhì)組學水平上的分析提供了技術(shù)支持.

關(guān)鍵詞：石斛； 花芽； 蛋白質(zhì)組學； 雙向電泳

金釵石斛(Dendrobiumnobile)為石斛屬多年生附生草本植物，是觀賞花卉，也是軟莖類(nobile type)觀賞春石斛最重要的育種親本[1]以及研究春石斛的模式植物，還是名貴的藥用植物，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳和明目強身等功效.關(guān)于金釵石斛的研究多集中在其生理、快繁和藥理方面[2-4].莊軍平等[5]構(gòu)建了金釵石斛花芽cDNA表達文庫，聞?wù)嬲涞萚6]初步揭示細胞分裂素對其開花的影響及分子機理，為研究金釵石斛的開花機理奠定了基礎(chǔ).

蛋白質(zhì)組學技術(shù)是從整體上研究生物細胞或組織內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成和相互作用規(guī)律的一門技術(shù).雙向凝膠電泳技術(shù)(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學研究中. 通過蛋白質(zhì)組學的方法比較分析不同條件下不同植物材料花芽蛋白表達[7-10]，尋找與成花相關(guān)的蛋白，結(jié)合生理形態(tài)等方面，對研究植物成花機理具有重要的理論意義. 目前國內(nèi)對于石斛雙向電泳的研究報道較少，董婧等[7]構(gòu)建了石斛葉片蛋白質(zhì)雙向電泳體系，對樣品制備、上樣量、PAGE膠濃度、染色方法進行了優(yōu)化，最終得到的蛋白斑點數(shù)約為613個.有關(guān)文獻表明，目前葡萄果實[8]能鑒定到445個蛋白，早酥梨花芽[9]鑒定到約900個蛋白點，水稻谷粒[10]中鑒定到1 100多個蛋白點. 得到了與特定生理過程相關(guān)的蛋白，但得到的蛋白點都偏少.目前尚未有金釵石斛花芽的蛋白質(zhì)組學報道.本研究旨對金釵石斛花芽蛋白質(zhì)的提取、水化方式、等點聚焦程序、IPG膠條選擇等方面進行優(yōu)化探索，為深入研究金釵石斛花芽蛋白質(zhì)組學奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1植物材料

金釵石斛(Dendrobiumnobile)，選取華南師范大學國蘭研究中心栽培2年的健壯、無病蟲害的金釵石斛成熟苗.在花芽長度為2 cm時取材，樣品液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2蛋白提取采用2種方法

1.2.1Tris-HCl緩沖液提取法對DAFNY-YELIN等[11]的方法改良，采用Tris-HCl緩沖液[0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，質(zhì)量分數(shù)為5%蔗糖和2%十二烷基硫酸鈉(SDS)，體積分數(shù)為5%β-巰基乙醇(β-ME)]提取，離心速度為18 000 r/min.

1.2.2酚抽提法在CARPENTIER等[12]方法的基礎(chǔ)上進行改良.取1.2 g 金釵石斛花芽在液氮中研磨成粉，加酚抽提液(0.7 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L KCl，50 mmol/L EDTA，0.5 mol/L Tris-base，30 mmol/L HCl，用前加2%β-ME)和Tris-飽和酚，4 ℃下21 956 r/min離心30 min，取上層酚相；下層水相加水-飽和酚，4 ℃下21 956 r/min離心30 min，再取上層酚相.合并2次酚相加預(yù)冷的0.1 mol/L 醋酸銨/甲醇，并在-20 ℃放置過夜.取過夜混合液4 ℃下27 316 r/min離心30 min，棄上清；沉淀加冷丙酮(含0.07%β-ME)洗滌，-20 ℃下放置30 min，4 ℃下25 464 r/min離心30 min，棄上清；沉淀加 80% 冷丙酮(含0.07%β-ME)洗滌，-20 ℃下放置30 min，4 ℃下25 464 r/min離心30 min，棄上清液.沉淀轉(zhuǎn)移至 1.5 mL離心管內(nèi)，冷丙酮(含0.07%β-ME)洗滌2次，真空抽濾，-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.3蛋白水化方式

Tris-HCl緩沖液提取法得到的干粉，按照1∶30比例加入水化液[8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，質(zhì)量分數(shù)為4% 3-(3-(胱酞胺基丙基)二甲氨基)丙磺酸鹽(CHAPS)和1%二硫蘇糖醇(DTT)，0.5%,1 mmol/L苯甲基磺酰氟PMSF].其中DTT和膠條緩沖液PMSF在使用前加入，IPG buffer在膠條水化時加入.以上含干粉的水化液在30 ℃水浴1 h，4 ℃下16 100 r/min離心40 min.酚抽提法得到的干粉，按照1∶40比例加入水化液，30 ℃水浴1 h，4 ℃下16 100 r/min離心40 min.蛋白定量使用BRADFORD法[13]. 目前蛋白的雙向電泳過程中的水化方式主要有2種.

1.3.1主動水化膠條兩端加上比較低的電壓，促進樣品進膠，一般電壓設(shè)置為50 V.

1.3.2被動水化膠條兩端不加電壓，一般在室溫20 ℃左右均可選擇被動水化.

1.4雙向電泳

膠條(購自Bio-Rad(USA)公司)的選擇分別從長度(7、17、24 cm)、pH范圍、線性(linear, L)或非線性(nonlinear, NL)等方面進行考慮.pH 3～10膠條容易估計蛋白的等電點， pH 3～10NL膠條能得到pH在5～7之間較高的分辨率.4種不同的第一向等電聚焦[IEF，isoelectric focusing (GE, USA)]程序基本參照Bio-Rad (USA)提供的操作手冊，對具體聚焦程序稍作改良(表1).IEF結(jié)束之后，均用水將膠條上附著的礦物油清洗干凈，進行膠條平衡.在平衡緩沖液Ⅰ[6 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，質(zhì)量分數(shù)為30%甘油、2%SDS，1% DTT]中平衡15 min后，在平衡緩沖液Ⅱ[6 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，質(zhì)量分數(shù)為30%甘油、2%SDS，2.5%IAA]中平衡15 min.2步平衡后，取出膠條后進行第二向SDS-PAGE電泳[14].SDS-PAGE采用12%的分離膠.

表1　等電聚焦程序

注：*VH為等點聚焦S5階段的設(shè)定單位，伏時

1.5凝膠固定染色與圖譜分析

凝膠水洗2次，每次 15 min，水平搖床震蕩；倒掉水后倒入固定液(甲醇40%、乙酸10%，水溶解混勻)固定2 h，水平搖床震蕩；倒掉固定液，水洗凝膠2次，水平搖床震蕩，每次15 min；倒掉水后倒入染色液(0.12%考馬斯亮蘭G-250，10%硫酸銨，10%正磷酸，20%甲醇)染色17 h，水平搖床震蕩，然后用雙蒸水清洗至背景為無色.脫色后的凝膠用Image Scanner Ⅲ圖像掃描系統(tǒng)(GE Healthcare, USA)掃描.獲得的圖譜用PDquest 7.4(Bio-Rad，USA)進行圖譜分析.

2結(jié)果與討論

2.1蛋白質(zhì)樣品制備方法的選擇及優(yōu)化

圖1表明，酚抽提法和改良的Tris-HCl緩沖液提取法獲得的蛋白點數(shù)分別為125個和139個. 酚抽提法獲得的蛋白得率較高、溶解性較好(表2)；改良的Tris-HCl緩沖液提取液得到的樣品干粉含較多雜質(zhì)，呈灰色粉末狀，溶解性較差.從雙向電泳圖譜來看，條紋的出現(xiàn)導致2-DE圖譜分辨率降低，蛋白點檢測難度增加[15]，酚抽提法得到的圖譜分辨率較高.因此，在后續(xù)的實驗中均采用酚抽提法制備樣品.

圖1　2種方法提取所獲金釵石斛花芽總蛋白的雙向電泳圖譜(7 cm，pH 3～10 NL膠條, a、b為局部放大圖)

Figure 1Representative 2-DE protein maps of totalD.nobileflower bud proteins by two extraction methods (7 cm pH 3～10 NL gradient IPG strip); a and b are enlargements of the framed parts in A and B, respectively.

表22種提取方法效果

Table 2Comparison of 2-DE maps from two different extraction methods

項目改良的Tris-HCl緩沖液提取法酚抽提法樣品干粉灰色粉末狀白紙狀蛋白得率/%0.4～0.51.0～2.0蛋白溶解性較差較好蛋白點質(zhì)量有一定程度橫縱紋較為規(guī)范,圓形或橢圓形圖譜背景較深較淺條紋干擾略多較少電流高低

提取植物材料蛋白的方法主要有TCA/丙酮法、Tris-HCl法和酚抽提法等.金釵石斛花芽中含有大量石斛多糖等，影響蛋白樣品制備及后續(xù)電泳過程.采用酚抽提法能有效去除金釵石斛花芽材料中的多糖、離子及核酸[16]，獲得較高蛋白產(chǎn)量，減少條紋干擾，與歐高政等[17]采用酚抽提法提取龍眼花芽蛋白的研究一致.

2.2水化方式的選擇

對金釵石斛花芽蛋白采用主動水化(圖2A)所得到的圖譜pI在5.0，大小在66 200 u左右的蛋白點未分開，且部分蛋白點出現(xiàn)縱向拖尾現(xiàn)象， PDquest 7.4軟件分析得到661個蛋白點；而被動水化(圖2B)得到的電泳圖譜背景相對干凈，酸性端大分子量的蛋白點分離效果比主動水化好，縱向條紋較少，所得到的蛋白點較清晰、形狀規(guī)則，蛋白點達775個.

低電壓下主動水化可促進樣品中鹽分的去除，利于大分子量蛋白進入膠條，但會造成部分小分子量蛋白的損失[18].被動水化能確保小分子量蛋白在第一向膠條中得到良好的分離.

A為主動水化，B為被動水化；a、b為局部放大圖

Figure 2Representative 2-DE protein maps of total proteins ofD.nobileflower bud by two different hydration methods.(17 cm pH 3～10 NL gradient IPG strip)

2.3等電聚焦程序優(yōu)化

對金釵石斛花芽蛋白采用IEF程序B1聚焦，聚焦電流偏高，達不到預(yù)設(shè)電壓10 000 V； 2-DE圖譜(圖3A)背景深，整體上蛋白點未分開，縱向條紋明顯且出現(xiàn)橫向拖尾，可能與等點聚焦不充分有關(guān)[19].采用IEF程序B2聚焦， 樣品的除鹽效果優(yōu)于IEF程序B1， 聚焦電流介于15～20 uA/ strip之間， 聚焦電壓達到設(shè)定值10 000 V得到的2-DE圖譜(圖3B)背景干凈，蛋白點清晰基本無拖尾現(xiàn)象，蛋白點形狀規(guī)則，呈圓形或橢圓形.PDquest 7.4軟件分析結(jié)果表明，采用IEF程序B1和IEF程序B2，分別得到了164和443個蛋白點. 要獲得高質(zhì)量的電泳圖譜，關(guān)鍵是IEF分離效果.閆偉麗等[20]對等點聚焦參數(shù)進行了優(yōu)化.本實驗通過漸進式升壓的方式，延長除鹽時間，為搭建鹽橋提高了IEF的質(zhì)量.

2.4IPG膠條選擇

比較了4種膠條的等電聚焦結(jié)果：17 cm pH 5～8膠條(圖4A),可能其pH 范圍較窄，膠條pH范圍以外的 pH>8 堿性端，以及pH<5 的酸性端蛋白點重疊成較大蛋白帶；17 cm pH 3～10或pH 3～10 NL膠條(圖4B、C),雖然蛋白酸性端和堿性端被分開，但大部分蛋白集中在pH 4～9 之間，分辨率較差；24 cm pH 3～10 NL膠條(圖4D)上酸性和堿性端蛋白很好分離，中性蛋白均勻分布，形狀規(guī)則.分析表明，17 cm pH 5～8膠條、17 cm pH 3～10膠條、17 cm pH 3～10 NL膠條、24 cm pH 3～10 NL膠條所得到的蛋白點數(shù)分別為767、443、775、1 254個. IPG膠條的選擇與材料中蛋白分布、目的蛋白性質(zhì)等相關(guān).總體上看，24 cm pH 3～10 NL膠條圖譜清晰，蛋白點數(shù)目增加，分離效果優(yōu)于其它膠條.

2.5雙向電泳的重復(fù)性

對金釵石斛花芽總蛋白質(zhì)的2次平行實驗用24 cm pH 3～10 NL膠條分離. PDquest 7.4(Bio-Rad, USA) 軟件進行蛋白質(zhì)點檢測及匹配分析(圖5A、B)，分別檢測到約1 422和1 320個蛋白點，匹配率到達92.8%.利用 PDquest 7.4軟件分析，大部分點重疊呈現(xiàn)黃色(圖5C)，顯示重復(fù)性好. 重復(fù)性是整個蛋白質(zhì)組學技術(shù)中一個重要的環(huán)節(jié)，從蛋白點的分離效果、蛋白點的數(shù)量、凝膠的背景等幾個方面來看，本研究所得的雙向電泳圖譜重復(fù)性及穩(wěn)定性均好.

A：IEF程序B1;B：IEF程序B2;a、b為局部放大圖.

圖3不同IEF程序所獲金釵石斛花芽總蛋白的雙向電泳圖譜(17 cm， pH 3～10 NL膠條)

Figure 3Representative 2-DE protein maps of totalD.nobileflower bud proteins by two different IEF procedures (17 cm pH 3～10 gradient IPG strip)

圖4　4種不同膠條所獲金釵石斛花芽總蛋白的雙向電泳圖譜

A和B分別為2次平行實驗的2-DE圖譜;C為利用PDquest 7.4 軟件對圖A、B以不同熒光(紅色，綠色)顯示并進行重疊(24 cm, pH 3～10 NL膠條)

圖5金釵石斛花芽蛋白兩次2-DE平行實驗

Figure 5Comparative analyses of two 2-DE experimental maps of theD.nobileflower bud proteins

3結(jié)論

筆者以金釵石斛花芽為實驗材料，建立了適用于金釵石斛花芽蛋白分析的雙向電泳體系：酚抽提法，樣品與水化液1∶40復(fù)溶；被動水化，IEF程序B2，選用24 cm pH 3～10NL 膠條和12% 的凝膠分離蛋白；考馬斯亮藍G-250染色，得到了背景清晰、1 422個蛋白斑點且分辨率高的雙向電泳圖譜，為金釵石斛花芽在蛋白質(zhì)組學水平上的后續(xù)分析提供了技術(shù)支持.

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【中文責編：成文英文責編:李海航】

Optimization of Protein Extraction and Two-Dimensional Electrophoresis of theDendrobiumnobile. Flower Bud

YE Jie, YIN Limei, YE Qingsheng*

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, School of Life Sciences,South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Abstract：To establish the two-dimensional gel electrophoresis system of Dendrobium nobile flower bud proteins and gain a higher reproducibility and resolution, the proteins of D. nobile flower bud were extracted by optimized phenol method. The sample was passively rehydrated by dissolving in 40-fold (w/v) rehydration solution. Isoelectric focusing was performed in Program B2, using 24 cm pH 3-10NL gradient IPG strip and 12% SDS-PAGE. The gel was stained with Coomassie brilliant blue G-250. By this modified method, the 2-D electrophoretic maps of the D. nobile flower bud proteins showed 1 422 protein spots, with high repeatability and high resolution. This work provides a good method for proteomic analysis of D. nobile flower buds.

Key words：Dendrobium; flower bud; proteomics; 2-D electrophoresis

中圖分類號：Q946.1； S682.31

文獻標志碼：A

文章編號:1000-5463(2016)02-0067-07

*通訊作者:葉慶生，教授，Email: ye-lab@scnu.edu.cn.

基金項目：廣東省自然科學基金重點項目(10251063101000013)

收稿日期：2015-05-07《華南師范大學學報(自然科學版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n