方　晨，張　釗，韋祥相，李賢梅，張小雪

(貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)系，貴州 貴陽(yáng) 550025)

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亮甲酚藍(lán)染色法評(píng)價(jià)斑馬魚卵母細(xì)胞體外成熟度的實(shí)驗(yàn)研究

方晨，張釗，韋祥相，李賢梅，張小雪*

(貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)系，貴州 貴陽(yáng) 550025)

摘要：通過不同濃度亮甲酚藍(lán)(BCB)對(duì)斑馬魚卵母細(xì)胞進(jìn)行染色，探討該方法用于判斷魚類卵母細(xì)胞成熟度的可行性，并利用該法對(duì)孕酮促斑馬魚卵母細(xì)胞體外成熟實(shí)驗(yàn)中的卵母細(xì)胞成熟情況進(jìn)行了判斷和分析。結(jié)果表明：(1)BCB染色法用于判斷魚類卵母細(xì)胞成熟度是可行的。(2)低濃度(1 nmol/L和10 nmol/L)孕酮處理6 h，對(duì)斑馬魚卵母細(xì)胞的成熟并無明顯促進(jìn)作用，高濃度的孕酮(100 nmol/L和1000 nmol/L)不利于卵母細(xì)胞的成熟。(3)濃度為100 nmol/L的孕酮處理12 h，對(duì)卵母細(xì)胞成熟的促進(jìn)作用顯著。

關(guān)鍵詞：亮甲酚藍(lán)(BCB)；斑馬魚；卵母細(xì)胞；孕酮

與傳統(tǒng)動(dòng)物育種技術(shù)相比較，現(xiàn)代育種技術(shù)縮短了產(chǎn)生新品種的時(shí)間，對(duì)所要求的性狀具有明確的針對(duì)性，因此逐漸受到動(dòng)物育種工作者的重視?，F(xiàn)代動(dòng)物育種的生物技術(shù)包括胚胎工程技術(shù)、動(dòng)物克隆技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)和電融合技術(shù)等，而在這些技術(shù)中常常需要成熟的卵母細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，為此卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)和成熟度的判斷已成為相關(guān)育種實(shí)驗(yàn)中必須解決的問題之一，同時(shí)也是現(xiàn)代動(dòng)物育種技術(shù)成功與否的重要前提。

目前，卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)研究多見于哺乳類，且技術(shù)相對(duì)成熟，如牛[1]、山羊[2]、豬[3]等，而關(guān)于水生脊椎動(dòng)物魚類的卵細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究還較少，僅見李書鴻等[4]對(duì)斑馬魚卵母細(xì)胞體外成熟條件進(jìn)行的研究。

卵母細(xì)胞的成熟包括核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟。對(duì)于卵母細(xì)胞成熟度的判斷，通常情況下是通過光學(xué)顯微鏡來觀察卵母細(xì)胞是否排除第一極體來作為核成熟的標(biāo)準(zhǔn)[5]，而在胞質(zhì)成熟上，還沒有確切的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。然而也有研究認(rèn)為：線粒體重排和皮質(zhì)顆粒遷移程度可作為卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的標(biāo)志[6]。在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中對(duì)魚類卵母細(xì)胞成熟度的判定往往是根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行，如成熟的卵母細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)為：生發(fā)泡破裂, 核仁消失, 紡錘體形成，染色質(zhì)濃縮為染色體, 第一極體的排出等[7], 但是在實(shí)際應(yīng)用過程中，該技術(shù)操作繁瑣，不易判斷卵母細(xì)胞的質(zhì)量。

近年來，為了準(zhǔn)確快速地判斷卵母細(xì)胞的成熟度，獲得高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)用卵母細(xì)胞，一種新的、無害方法——亮甲酚藍(lán)(BCB)染色法逐漸應(yīng)用于多種動(dòng)物卵母細(xì)胞的篩選[8]。亮甲酚藍(lán)(BCB)是一種生物染料，可被卵母細(xì)胞中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶作用由藍(lán)色變?yōu)闊o色，故通過BCB染色可以篩選出已完成生長(zhǎng)的即發(fā)育潛能較佳的卵母細(xì)胞。這一技術(shù)在小鼠、豬、牛、羊等多種哺乳動(dòng)物的體外生殖技術(shù)上得到了成功應(yīng)用[9-11]，而這一技術(shù)在魚類卵母細(xì)胞發(fā)育潛能篩選方面的應(yīng)用，目前尚未見報(bào)道。本研究采用亮甲酚藍(lán)染色法，對(duì)經(jīng)過孕酮誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞的成熟度進(jìn)行評(píng)估，目的是分析這種方法在判斷魚類卵母細(xì)胞成熟度的可行性以及該方法在孕酮促斑馬魚卵母細(xì)胞體外成熟實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用情況，為魚類的育種實(shí)驗(yàn)提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

17α-羥基孕酮(aladdin-e，上海)，膠原酶Ⅱ型(Solarbio，北京)，臺(tái)盼藍(lán)(genview，北京)，亮甲酚藍(lán)(源葉生物，上海)，青鏈酶素(Solarbio，北京)，二甲基亞砜(DMSO)( aladdin-e，上海)，DMEM培養(yǎng)液(Hyclone，美國(guó))，氯化鈉等化學(xué)試劑為分析純?cè)噭?/p>

1.2主要儀器

解剖鏡(Olympus， SZ61型)，顯微鏡(Olympus， CH20型) ，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化，SW-CJ-ID型)等。

1.3實(shí)驗(yàn)材料

1.3.1 實(shí)驗(yàn)用斑馬魚

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚購(gòu)買于貴陽(yáng)花鳥市場(chǎng)。飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖箱內(nèi)，水源為曝氣24 h以上的自來水, 水溫(26±2)℃，自然光照飼養(yǎng)。每天早晚投喂飼料各一次。每天早上吸污并換水1/4，飼養(yǎng)一段時(shí)間后，視殘餌及水質(zhì)而調(diào)整換水頻率。挑選腹腔飽滿，卵巢發(fā)育比較好的魚體用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 主要溶液配制

膠原酶消化溶液：準(zhǔn)確稱量0.015 g膠原酶溶入1 mlDMEM培養(yǎng)液中配成15%的母液存放在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)用時(shí)把母液稀釋50倍配成0.3%的膠原酶溶液用于分解組織。

孕酮母液：準(zhǔn)確稱量0.33 g羥基孕酮溶于10 ml二甲基亞砜中，配成0.1 mol/L的儲(chǔ)存液于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

臺(tái)盼藍(lán)溶液：準(zhǔn)確稱量0.4 g臺(tái)盼蘭溶于10 ml 0.85%生理鹽水中配成4%母液存放在4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水把母液稀釋10倍配成0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液用于細(xì)胞染色。

亮甲酚藍(lán)溶液：準(zhǔn)確稱量0.166 g亮甲酚藍(lán)溶于10 ml0.85%生理鹽水水，配成0.05 mol/ L的母液于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水稀釋成20 μmol/ L的濃度用于細(xì)胞染色。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1卵母細(xì)胞獲取

從養(yǎng)殖箱中挑選腹腔飽滿的斑馬魚用于實(shí)驗(yàn)。魚體秤重(1.25±0.18) g，稱重后把魚體放在解刨盤中，將左體壁全部剪去，用解剖鑷取出2側(cè)的卵巢，卵巢稱重(0.26 ±0.04)g。

卵巢稱重后放入青鏈霉素中涮洗1-2次，取出后放在載玻片上用解剖刀切割成大小相同的小段(每小段30-50個(gè)卵母細(xì)胞左右)，然后放入膠原酶溶液中在20℃環(huán)境下酶解20 min左右，用生理鹽水涮洗卵母細(xì)胞3-4次以除去剩余的膠原酶后，置DMEM培養(yǎng)液中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2亮甲酚藍(lán)染色條件的篩選

設(shè)置10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L、和60 μmol/L六個(gè)亮甲酚藍(lán)染色濃度，和六個(gè)染色時(shí)間(30 min，60 min，90 min，120 min，150 min)，用亮甲酚藍(lán)對(duì)斑馬魚卵母細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)合卵母細(xì)胞的顯微測(cè)量，比較染色效果, 挑選效果最佳的染色組合用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3孕酮濃度和作用時(shí)間梯度的設(shè)置

取適量孕酮母液溶于二甲基亞砜(DMSO)中制成，用DMEM培養(yǎng)液稀釋成1 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L和1000 nmol/L 4個(gè)濃度，以0 nmol/L作為對(duì)照組。將前述準(zhǔn)備好的斑馬魚卵母細(xì)胞置不同濃度的孕酮溶液中于20℃溫度下培養(yǎng)。每次實(shí)驗(yàn)要保證每種濃度有2份卵母細(xì)胞(一份用于臺(tái)盼蘭染色，一份用于亮甲酚藍(lán)染色)，培養(yǎng)時(shí)間分別為6 h，12 h，24 h。

1.4.4臺(tái)盼藍(lán)染色

經(jīng)過不同時(shí)間孕酮培養(yǎng)后，取出一份用生理鹽水涮洗細(xì)胞3-4次后，加入臺(tái)盼藍(lán)溶液常溫下染色5 min，解剖鏡和顯微鏡觀察、拍照，并計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.4.5亮甲酚藍(lán)染色

經(jīng)過不同時(shí)間孕酮培養(yǎng)后，取出另一份用生理鹽水涮洗細(xì)胞3-4次后，加入亮甲酚藍(lán)20℃溫度下染色150 min(避光)，用解剖鏡和顯微鏡觀察、拍照，并計(jì)算細(xì)胞的成熟率。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用Excel和SPSS 17.0進(jìn)行分析，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果

2.1最佳亮甲酚藍(lán)染色條件

通過染色效果比較，并結(jié)合顯微測(cè)量結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出亮甲酚藍(lán)濃度在20 μmol/L、染色時(shí)間為150 min的染色效果最佳。(圖1)

圖1　亮甲酚藍(lán)染色的斑馬魚卵母細(xì)胞(10×10)Fig.1　Zebrafish oocytes stained by BCB

2.2孕酮處理后卵母細(xì)胞的存活率

臺(tái)盼藍(lán)染色鑒別細(xì)胞存活率(見圖2和表1)。

從表1可以看出，斑馬魚卵母細(xì)胞在不同濃度和不同時(shí)間孕酮處理后，存活率有一定波動(dòng)，孕酮濃度10 nmol/L和100 nmol/L分別處理6 h和12 h后斑馬魚卵母細(xì)胞的存活率有一定的增加，但總體來說孕酮對(duì)卵母細(xì)胞的存活率影響不大。

圖2　臺(tái)盼藍(lán)染色的卵母細(xì)胞(10×10)Fig.2　Zebrafish oocytes stained by Trypan blue

孕酮濃度(nmol/L)孕酮處理時(shí)間(h)61224078.57±2.5377.98±1.3478.24±1.31178.95±5.2475.18±5.1881.00±1.001092.68±2.6488.60±1.1088.91±0.6710090.63±3.2782.98±0.6284.46±1.25100078.26±4.8378.93±6.7982.35±2.91

2.5孕酮處理后卵母細(xì)胞的成熟情況

從表2可以看出：孕酮濃度在1 nmol/L、處理6 h，孕酮對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有一定的促進(jìn)作用，但與對(duì)照組比較，差異不顯著性(p=0.403)；孕酮濃度在100 nmol/L、處理12 h，孕酮對(duì)卵母細(xì)胞成熟的促進(jìn)作用顯著(p=0.008)。而100 nmol/L和1000 nmol/L孕酮濃度處理6 h，斑馬魚卵母細(xì)胞的成熟率反而下降明顯。在孕酮處理12 h和24 h，實(shí)驗(yàn)組(除孕酮濃度在100 nmol/L、處理12 h)和對(duì)照組卵母細(xì)胞成熟率明顯低于各組孕酮處理6 h的成熟率，差異都顯著(p<0.05)。

表2　不同濃度孕酮處理不同時(shí)間后斑馬魚卵

注：a表示與對(duì)照組差異不顯著，b表示與對(duì)照組差異顯著，c表示與對(duì)照組差異極顯著，下同。

從表3可以看出：孕酮處理6 h，濃度在1-1000 nmol/L區(qū)間斑馬魚卵母細(xì)胞半成熟的比率隨孕酮處理濃度的增加而增加，在100 nmol/L和1000 nmol/L劑量組半成熟的卵母細(xì)胞比率分別達(dá)47.92%和56.48%左右，與對(duì)照組相比差異顯著(p<0.05)。而處理12 h和24 h，隨著孕酮濃度的增加，斑馬魚卵母細(xì)胞的半成熟率變化不明顯，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異不顯著(p>0.05)。

表3　 不同濃度孕酮處理不同時(shí)間后斑馬魚卵母細(xì)胞的

3討論

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)是與卵母細(xì)胞能量代謝相關(guān)的一種酶，隨著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，其含量也在不斷變化。該酶在生長(zhǎng)期的卵母細(xì)胞內(nèi)活性很高，但在已完成生長(zhǎng)的卵母細(xì)胞中活性下降。在本實(shí)驗(yàn)中，亮甲酚藍(lán)對(duì)不同成熟度卵母細(xì)胞的染色，是隨著卵母細(xì)胞成熟度的加大而逐漸變深，呈現(xiàn)一個(gè)漸進(jìn)的過程，而不是突變的一個(gè)過程。因此，我們以染色最深、且觀察不到細(xì)胞核的卵母細(xì)胞判為成熟卵細(xì)胞，而把呈較淺藍(lán)色的卵母細(xì)胞判為半成熟卵母細(xì)胞。這種判斷與卵母細(xì)胞的成熟過程相符，因?yàn)樵诼涯讣?xì)胞的成熟過程中，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性呈現(xiàn)的是逐漸降低的過程，而不是表現(xiàn)為突然消失的現(xiàn)象。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中我們通過測(cè)量染色后的卵母細(xì)胞的卵泡直徑，通過直徑大小來判斷卵母細(xì)胞的成熟情況[12]，發(fā)現(xiàn)與BCB染色后的判斷基本吻合。因此，BCB染色法對(duì)判斷魚類卵母細(xì)胞成熟度是可行的。

卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)是指從卵巢中獲取未成熟卵，經(jīng)過適宜的體外培養(yǎng)條件，卵母細(xì)胞發(fā)育成熟并具有受精和胚胎發(fā)育能力。影響卵母細(xì)胞體外成熟的因素有很多，比如采集方法，卵泡大小及卵母細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)的溫度、時(shí)間、氣相環(huán)境、培養(yǎng)液及其 pH 值、激素等等。已有研究證明外源雌激素可以促進(jìn)動(dòng)物性腺發(fā)育[13]，但是外源激素的量和作用時(shí)間對(duì)于處于不同發(fā)育時(shí)期的卵母細(xì)胞的作用差異十分明顯。如本實(shí)驗(yàn)結(jié)果所表現(xiàn)的情況：用孕酮培養(yǎng)6 h后，加入低濃度孕酮(孕酮濃度1 nmol/L和10 nmol/L)卵母細(xì)胞的成熟率和對(duì)照組相比變化不大，推測(cè)低濃度孕酮對(duì)斑馬魚卵母細(xì)胞的成熟并無明顯促進(jìn)作用；但隨著孕酮濃度持續(xù)增加(孕酮濃度100 nmol/L和1000 nmol/L)，卵母細(xì)胞的成熟率和對(duì)照組相比反而有所下降且差異顯著，推測(cè)是高濃度的孕酮不利于卵母細(xì)胞的成熟。孕酮培養(yǎng)12 h和24 h后，對(duì)照組和大部分實(shí)驗(yàn)組的卵母細(xì)胞成熟率與6 h相比，均下降明顯且差異極顯著，推測(cè)是培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，培養(yǎng)的環(huán)境發(fā)生了變化導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟率下降，具體原因有待進(jìn)一步的研究。

上述研究表明，用亮甲酚藍(lán)染色來判斷魚類卵母細(xì)胞的成熟度，相對(duì)于其他的判斷方法，有便捷且能保持卵母細(xì)胞存活等優(yōu)勢(shì)，因此，可作為魚類卵母細(xì)胞現(xiàn)代育種技術(shù)的輔助手段。關(guān)于魚類卵母細(xì)胞體外成熟過程中孕酮的最佳用量和處理時(shí)間，估計(jì)與處理前卵母細(xì)胞的成熟度以及培養(yǎng)后期的環(huán)境有密切關(guān)系，如何根據(jù)體外成熟培養(yǎng)前卵母細(xì)胞的成熟情況進(jìn)行外源激素孕酮的濃度調(diào)整，還有待進(jìn)一步研究。

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An experimental study on the evaluation of thematurity of zebrafish oocytesin vitro using brilliant cresyl blue staining

FANGChen,ZHANGZhao,WEIXiang-xiang,LIXian-mei,ZHANGXiao-xue*

(AnimalScienceCollege,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Abstract:The feasibility of the brilliant cresyl blue (BCB) staining method to determine the maturity of zebrafish oocytes in vitro was investigated by staining the zebrafish oocytes in different concentrations of BCB. The method was also used to determine and analyse the maturity of zebrafish oocytes in vitro promoted by progesterone. The results showed: (1)it is indeed feasible to employ BCB staining method to determine the maturity of the oocytes; (2)treatment in the low concentrations of progesterone (1nmol/L and 10nmol/L) for 6 hours had no significant effect on the maturation of zebrafish oocytes while the high concentrations of progesterone (100nmol/L and 1000nmol/L) were not suitable for the oocytes to mature; (3)the treatment in the concentration of 100nmol/L progesterone for 12 hours had significant effect in promoting the maturity of the oocytes.

Keywords:Brilliant cresyl blue (BCB); Zebrafish; Oocytes; Progesterone.

文章編號(hào)：1008-0457(2016)01-0009-05國(guó)際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.003

中圖分類號(hào):S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

*通訊作者：張小雪(1962-)，女，教授，主要研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物繁殖與發(fā)育生物學(xué)；E-mail：zhangxx508@163.com。

基金項(xiàng)目：貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金[黔省專合字(2009)102號(hào)]；貴州大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目[貴大人基合字(2007)003]。

收稿日期：2015-12-07；修回日期：2016-01-11