韓延忠　周永峰　桑秀秀　劉慧敏　崔鶴蓉　孟雅坤　李光全　賀蘭芝　尹萍　王伽伯　柏兆方　肖小河

[摘要]該文研究氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）抑制H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷的作用及其機(jī)制。以人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞L02為研究對(duì)象，采用H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激建立肝損傷模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)CCK8檢測(cè)OMT對(duì)L02細(xì)胞活性的影響；CSFE熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OMT對(duì)L02細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)OMT對(duì)H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡率的影響；DCFHDA熒光探針檢測(cè)OMT對(duì)H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞內(nèi)ROS含量；微板比色法檢測(cè)OMT對(duì)GSHPX和SOD活性的影響。結(jié)果顯示，OMT在625～100 mg·L-1通過(guò)誘導(dǎo)NADPH的產(chǎn)生，增強(qiáng)L02細(xì)胞內(nèi)GSHPX酶和SOD酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)GSH介導(dǎo)的活性氧ROS的清除，從而抑制H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡的發(fā)生，達(dá)到抑制H2O2誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷的作用。

[關(guān)鍵詞] 山豆根；氧化苦參堿；H2O2；氧化應(yīng)激；過(guò)氧化物酶

[Abstract]To investigate the protective effects of oxymatrine （OMT） against H2O2induced damage in L02 cells and research the mechanism，L02 cells were used as the research object. The oxidative stress model of L02 was established by hydrogen peroxide （H2O2） CCK8 was used to detect the cell activation of L02 cells treated by different OMT FCM （flow cytometry） assay was used to evaluate the cell proliferation of L02 cells treated by OMT The apoptosis of L02 cells was detected using AnnexinV/7AAD apoptosis detection kit The level of ROS was detected by DCFHDA fluorescence probe The GSHPX and SOD were detected by micro plate and colorimetric method Results showed that when the concentration of OMT is between 625 and 100 mg·L-1， it could promote the production of NADPH and strengthen the activity of GSHPX and SOD to get rid of the ROS to protect the L02 cell from the apoptosis of L02 cell induced by H2O2

[Key words]Subprostrate sophora； oxymatrine； H2O2； oxydatve stress； peroxydase

doi：10.4268/cjcmm20160723

近年來(lái)肝病發(fā)生率的逐年上升已引起社會(huì)的廣泛關(guān)注，是我國(guó)目前較為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。肝病的發(fā)生必然會(huì)引起肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷，而活性氧引發(fā)的氧化應(yīng)激又是多種肝病發(fā)生的病理基礎(chǔ)[1]，如脂肪肝、酒精肝、病毒性肝炎、肝纖維化等[25]，因此氧化應(yīng)激在肝病發(fā)生發(fā)展中的作用不容小覷。山豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep的干燥根和根莖，是一種清熱解毒類中藥，苦參堿類物質(zhì)是山豆根的主要化學(xué)成分之一[6]。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿類成分具有良好的保肝降酶作用，能防止多種原因引起的肝損傷，例如氧化苦參堿可以抑制四氯化碳引起的化學(xué)性肝損傷[7]、爆發(fā)性肝損傷[8]、缺血再灌注肝損傷[9]、病毒性肝損傷[10]。而上述各種類型的肝損傷各種機(jī)制間相互影響，錯(cuò)綜復(fù)雜。例如國(guó)際上公認(rèn)的脂肪肝發(fā)病機(jī)制“二次打擊學(xué)說(shuō)”：是指在氧化應(yīng)激和免疫細(xì)胞因子2個(gè)方面共同作用，相互影響下，引起脂肪性肝炎，進(jìn)而發(fā)展成肝纖維化和肝硬化的過(guò)程[1]。近年來(lái)氧化苦參堿保肝作用的研究主要側(cè)重于其免疫調(diào)節(jié)作用，抗氧化保肝作用的報(bào)道較少。本研究通過(guò)建立H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞氧化應(yīng)激肝細(xì)胞損傷模型，研究氧化苦參堿的抗氧化作用及其保護(hù)機(jī)制，為深入研究其在多種肝病治療上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料

正常人肝細(xì)胞株L02細(xì)胞購(gòu)自江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2且飽和濕度條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

DMEM完全培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自GIBCO公司；過(guò)氧化氫（H2O2）購(gòu)自Sigma公司；Cell Counting Kit8（CCK8）購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；ANNEXINⅤFITC/7AAD apoptosis detection kit購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司；CFSE Cell Division Tracker Kit購(gòu)自Biolegend公司；氧化苦參堿（OMT）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒（reactive oxygen species kit）、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（BCA protein assay kit）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒（cellular glutathione peroxidase assay kit）均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

酶標(biāo)儀（BioTek Synergy H1 H1MFD， 美國(guó)）；二氧化碳培養(yǎng)箱（NAPCO Model 5410，美國(guó)）；臺(tái)式低速離心機(jī)（TD5A，湖南赫西儀器裝備有限公司）；流式細(xì)胞儀（BD FACS Canto Ⅱ）。

2方法

21L02細(xì)胞的培養(yǎng)L02細(xì)胞培養(yǎng)按照常規(guī)培養(yǎng)的方法，含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素的高糖培養(yǎng)基 DMEM，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

22CCK8檢測(cè)OMT對(duì)L02細(xì)胞活性的影響為了排除OMT對(duì)L02細(xì)胞毒性的劑量范圍，將L02細(xì)胞以70×104個(gè)/mL接種到96孔板，每孔100 μL，接種12 h細(xì)胞全部貼壁后，分別給質(zhì)量濃度為3 200，1 600，800，400，200，100，50，25，125，625，312，156 mg·L-1的OMT， 實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔，且每個(gè)濃度下設(shè)5個(gè)復(fù)孔，24 h后CCK8檢測(cè)L02細(xì)胞的增值率。細(xì)胞增值率=（As-Ac）/（Ac-Ab）×100%，式中Ac為對(duì)照孔吸光度；As為實(shí)驗(yàn)孔吸光度；Ab為空白孔吸光度。

23CSFE染色法檢測(cè)OMT對(duì)L02細(xì)胞增殖的影響采用CSFE 染色法對(duì)L02細(xì)胞進(jìn)行染色，染色過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將L02 細(xì)胞以10×105個(gè)/mL接種到12孔板中，每孔1 mL ， 接種12 h后分別給質(zhì)量濃度為50，25，125，625 mg·L-1的OMT對(duì)L02細(xì)胞刺激，每個(gè)濃度下設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24 h消化細(xì)胞，將消化下來(lái)的細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)。

24L02細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立將濃度為70×104個(gè)/mL的L02細(xì)胞接種到96孔板，每孔100 μL， 接種12 h細(xì)胞全部貼壁后，設(shè)08，07，06，05，04，03，02，01 mmol·L-1濃度梯度的H2O2進(jìn)行造模，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔，且每個(gè)濃度下設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別在造模05，1，2，3，4 h后用PBS清洗2遍，再用CCK8檢測(cè)L02細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。細(xì)胞的存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%。

25ANNEXINFITC/7AAD法檢測(cè)凋亡細(xì)胞雙氧水建立氧化損傷模型，可以增加胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而發(fā)生胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡，即凋亡[15]，因此本實(shí)驗(yàn)直接采用流式方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡來(lái)證明OMT的抗氧化作用。將L02細(xì)胞按照10×105個(gè)/mL接種到12孔板中，設(shè)空白組、模型組和給藥組，每孔2 mL，接種12 h后，模型組和給藥組分別按照24項(xiàng)下造模條件造模，05 h后，給藥組分別給質(zhì)量濃度為50，25，125，625 mg·L-1的OMT對(duì)L02細(xì)胞刺激，給藥24 h后，將L02細(xì)胞消化下來(lái)，按照ANNEXINⅤFITC/7AAD說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行流式檢測(cè)L02細(xì)胞凋亡情況。

26L02細(xì)胞內(nèi)SOD，GSHPX活力測(cè)定用6孔板培養(yǎng)L02細(xì)胞，分組、造模、給藥如前，最后每孔加200 mL PBS，反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，然后1萬(wàn)r·min-1離心10 min，取上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定吸光度（A），并計(jì)算SOD，GSHPX活力。

27L02細(xì)胞內(nèi)ROS含量測(cè)定用12孔板培養(yǎng)L02細(xì)胞，分組、造模、給藥如前，最后清洗細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)運(yùn)用原位裝載探針的方法進(jìn)行胞內(nèi)染色，染色20 min，用PBS清洗3次，完畢用胰酶消化，加完全培養(yǎng)基終止消化，1 500 r·min-1離心，棄上清，最終用200 μL的PBS重懸。在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm下進(jìn)行流式檢測(cè)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

28統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 200統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，P<005表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31CCK8檢測(cè)OMT對(duì)L02細(xì)胞活性的影響OMT作用于L02細(xì)胞24 h后，OMT質(zhì)量濃度在32～100 mg·L-1時(shí)增強(qiáng)L02細(xì)胞活性，并且在125 mg·L-1時(shí)對(duì)L02細(xì)胞活性最強(qiáng)；OMT質(zhì)量濃度在400～3 200 mg·L-1時(shí)對(duì)L02細(xì)胞有毒性作用，并且隨著OMT濃度的增加毒性作用增強(qiáng)（圖1）?；谏鲜鼋Y(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用625，125，25，50 mg·L-1的質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

32CSFE染色法檢測(cè)OMT對(duì)L02細(xì)胞增殖的影響根據(jù)CSFE熒光的倍減程度顯示，空白對(duì)照組在24 h內(nèi)自然增殖3代，L02細(xì)胞被不同濃度OMT刺激24 h后，各個(gè)OMT濃度下的L02細(xì)胞也增殖3代，與空白組相比，未出現(xiàn)增殖小峰，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明OMT不能促進(jìn)L02細(xì)胞的增殖（圖2，表1）。基于CCK8檢測(cè)結(jié)果和原理，以及CSFE檢測(cè)結(jié)果，表明OMT可以促進(jìn)L02細(xì)胞內(nèi)NAD（P）H的增加。

33L02細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立本研究首先考察H2O2濃度和刺激時(shí)間對(duì)L02細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果顯示隨著H2O2濃度的增加，L02細(xì)胞的存活率逐漸降低，且趨勢(shì)逐漸趨于平緩；隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，相同H2O2濃度下的L02細(xì)胞的存活率逐漸降低（圖3）。綜合考慮造模時(shí)間和造模濃度，以半數(shù)致死量為原則，本研究選擇造模時(shí)間為05 h和造模濃度為03 mmol·L-1的H2O2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

34ANNEXIN ⅤFITC/7AAD法檢測(cè)凋亡細(xì)胞H2O2造模后L02細(xì)胞的凋亡率為256%±36%，較空白組明顯增加（P<005）；分別給625，125，25，50 mg·L-1的OMT干預(yù)后，凋亡率明顯下降，分別為112%±25%，998%±39%，138%±31%，153%±24%（P<005）；凋亡率與給藥

濃度呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，并且OMT在125 mg·L-1時(shí)抑制凋亡作用最強(qiáng)（圖4）。

35L02細(xì)胞內(nèi)SOD，GSHPX活力、ROS含量測(cè)定OMT抑制雙氧水對(duì)L02細(xì)胞的損傷中SOD，GSHPX活力變化，與空白組相比，模型組中SOD活性顯著降低（P<005），GSHPX活性顯著降低（P<001）；與模型組比較，給藥組中SOD活性均顯著升高（P<005，P<001）、GSHPX活性均顯著升高（P<001），且OMT在125 mg·L-1時(shí)二者活性升高最多；與正常對(duì)照組相比，模型組中ROS

含量顯著升高（P<001）；與模型組相比，給藥組

4討論

苦參素（即氧化苦參堿）是從豆科槐屬植物苦參、廣豆根、管萼山豆根等植物中提取的生物堿，臨床上主要用于治療慢性乙型病毒性肝炎，臨床效果確切，是中華醫(yī)學(xué)會(huì)重點(diǎn)推廣治療乙型肝炎的藥物之一，同時(shí)對(duì)多種肝損傷也有較好的保護(hù)效果[16]。肝病的發(fā)生必然會(huì)引起肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷，活性氧引發(fā)的氧化應(yīng)激又是多種肝病發(fā)生的病理基礎(chǔ)[1]，近年來(lái)氧化苦參堿的保肝作用機(jī)制研究主要集中在免疫調(diào)節(jié)方面，其在整體動(dòng)物水平的抗氧化保肝作用報(bào)道較少。并且相比動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的整體性和作用機(jī)制的復(fù)雜性，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)影響因素比較單一，具有動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)所不具備的優(yōu)勢(shì)與特色，能更為直接的說(shuō)明其抗氧化作用。因此本實(shí)驗(yàn)采用H2O2致L02細(xì)胞 （肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞）氧化應(yīng)激損傷模型，單純從抗氧化作用方面來(lái)探討氧化苦參堿（OMT）的保肝作用。

CCK8檢測(cè)法是一種檢測(cè)細(xì)胞增值活性的常用方法，結(jié)果顯示，L02細(xì)胞在接受OMT刺激后，增殖活性增強(qiáng)；而采用CSFE細(xì)胞分裂跟蹤法檢測(cè)，結(jié)果顯示L02細(xì)胞未出現(xiàn)增值現(xiàn)象?；谏鲜?種矛盾的結(jié)果分析：CSFE細(xì)胞分裂跟蹤法是一種更直接檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法，其結(jié)果更準(zhǔn)確，OMT不能促進(jìn)L02細(xì)胞的增殖；CCK8檢測(cè)法是一種間接檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法，其檢測(cè)原理是通過(guò)檢測(cè)96孔細(xì)胞板中NAD（P）H增加的多少來(lái)間接說(shuō)明細(xì)胞的增殖。所以CCK8結(jié)果表明，L02細(xì)胞接受OMT刺激后，實(shí)驗(yàn)孔中NAD（P）H總含量增加。綜合2種方法的結(jié)果，本課題組判斷，OMT可以促進(jìn)單個(gè)L02細(xì)胞內(nèi)NAD（P）H含量增加。而NADPH是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成成分，對(duì)于維持GSH的還原狀態(tài)，保證細(xì)胞清除導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷的毒性物質(zhì)ROS具有重要意義 [18]。因此可以推測(cè)OMT可能有抗氧化保肝作用。

為此，本課題組采用雙氧水建立氧化應(yīng)激損傷模型來(lái)證明上述推測(cè)。但是由于H2O2的不穩(wěn)定性、細(xì)胞種類以及人為等因素的存在，不同文章中的H2O2的造模濃度及造模時(shí)間存在很大差異[1114]，本實(shí)驗(yàn)綜合考慮造模時(shí)間和造模濃度因素，以半數(shù)致死量為原則，最終選擇造模時(shí)間為05 h和造模濃度為03 mmol·L-1的H2O2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

基于上述造模條件，再給予一定濃度的OMT刺激，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿明顯降低了L02細(xì)胞的凋亡率，且在125 mg·L-1時(shí)，凋亡率最小，說(shuō)明OMT在一定濃度范圍內(nèi)可以抑制H2O2誘導(dǎo)的L02細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡。

DCFHDA熒光探針?lè)z測(cè)發(fā)現(xiàn)雙氧水損傷L02細(xì)胞后，模型組產(chǎn)生了大量的活性氧ROS，并且細(xì)胞凋亡比例明顯增加。SOD，GSHPX均屬于內(nèi)源性的抗氧化酶，可以直接清除活性氧ROS，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L02細(xì)胞被雙氧水損傷后，胞內(nèi)的SOD，GSHPX活性明顯降低，給藥后，二者活性顯著增強(qiáng)，同時(shí)胞內(nèi)ROS含量明顯降低，細(xì)胞凋亡比例明顯下降，提示OMT可以通過(guò)增強(qiáng)SOD，GSHPX活性，從而清除活性氧ROS來(lái)降低凋亡的發(fā)生。

綜上所述，氧化苦參堿OMT可以增強(qiáng)L02細(xì)胞內(nèi)的SOD，GSHPX活性以及NADPH的含量來(lái)清除H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧 ROS，從而減輕氧化損傷所造成的細(xì)胞凋亡。氧化苦參堿或可以作為一種抗氧化保肝藥物的前體藥物來(lái)進(jìn)一步研發(fā)。

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[責(zé)任編輯馬超一]