李金洵, 徐思源, 金　偉

(1 湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部， 湖北 武漢 430068； 2 中國(guó)環(huán)境干部管理學(xué)院， 河北 秦皇島 066000 )

缺氮對(duì)血球藻光系統(tǒng)II蝦青素變化的影響

李金洵1, 徐思源2, 金偉2

(1 湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部， 湖北 武漢 430068； 2 中國(guó)環(huán)境干部管理學(xué)院， 河北 秦皇島 066000 )

[摘要]血球藻(Haematococcus pluvialis)是一種生活在淡水的單細(xì)胞生物，綠藻綱,被認(rèn)為是理想的天然蝦青素生產(chǎn)“工廠”。以代表性血球藻192.80為實(shí)驗(yàn)材料，研究缺氮條件下其光系統(tǒng)II(PSII)光化學(xué)變化與其次級(jí)代謝產(chǎn)物蝦青素積累的變化之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氮條件下，蝦青素含量、葉綠素相對(duì)含量和細(xì)胞密度均顯著低于全培養(yǎng)基處理組(P<0.05)，而蝦青素干重比值卻顯著高于全培養(yǎng)基處理組(P<0.05)；藻細(xì)胞的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)下降到初始值85%左右后，在紅色孢子中卻呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而rETR呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。結(jié)果顯示了血球藻響應(yīng)氮脅迫的特殊保護(hù)機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]血球藻；蝦青素；光系統(tǒng)II；缺氮

血球藻(Haematococcuspluvialis)是蝦青素的天然來(lái)源。幼期的血球藻呈綠色，在營(yíng)養(yǎng)鹽限制、高光強(qiáng)、高鹽濃度等惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境下，這些細(xì)胞將會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)和生化方面的改變，轉(zhuǎn)變成紅色的厚壁孢子，同時(shí)開(kāi)始積累蝦青素[1-3]。

天然蝦青素消除自由基和抗氧化的能力非常強(qiáng)，所以逐漸受到市場(chǎng)的重視和喜愛(ài)。能夠?qū)π哪X血管疾病的治愈及術(shù)后修復(fù)產(chǎn)生積極的推動(dòng)作用，在藥物、保養(yǎng)品、營(yíng)養(yǎng)品等多個(gè)領(lǐng)域都有著廣闊的市場(chǎng)前景。而血球藻是生產(chǎn)天然蝦青素的最好的生物來(lái)源，具有非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。研究血球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)與蝦青素含量的關(guān)系少有報(bào)道。大量研究表明，對(duì)植物葉綠素?zé)晒獾姆治鼋Y(jié)果一定程度上反映了其光合作用情況[4]，同時(shí)也可以反映其抵抗惡劣環(huán)境的能力。該方法測(cè)量速度較快且誤差小，能同時(shí)反映植物的生長(zhǎng)狀態(tài)和光合作用情況[5-6]。

本次實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)對(duì)血球藻的葉綠素?zé)晒庾兓?guī)律的研究，將不同的生長(zhǎng)環(huán)境作為變量，以此來(lái)研究與蝦青素變化之間的關(guān)系，從而達(dá)到通過(guò)改變外界培養(yǎng)條件來(lái)優(yōu)化血球藻的生長(zhǎng)以及提高蝦青素產(chǎn)量。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)藻種

雨生紅球藻(Haematoccuspluvialis192.80)，來(lái)源于湖北工業(yè)大學(xué)(輕工學(xué)部)微藻實(shí)驗(yàn)室。

1.2微藻培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)使用量程為600 mL的column管( Φ4 cm)和 BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度為(25±1)℃，光照強(qiáng)度為200 μmol/(m2·s)，保證充分光照，持續(xù)通氣培養(yǎng)，做好防止貼壁的措施。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后離心收集綠色游動(dòng)細(xì)胞，分別接入BG-11全培養(yǎng)基及無(wú)氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中接入BG-11無(wú)氮培養(yǎng)基的藻細(xì)胞在收集后用無(wú)氮培養(yǎng)基洗滌2次后接入，接種濃度OD550 nm(藻細(xì)胞在550 nm處的吸光度)設(shè)為0.2，每組分別設(shè)置4個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)周期為14 d。每天同一時(shí)間取樣，測(cè)量生長(zhǎng)參數(shù)、葉綠素a、蝦青素和葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)參數(shù)。

1.3實(shí)驗(yàn)生長(zhǎng)數(shù)據(jù)測(cè)量方法

1.3.1細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)參考文獻(xiàn)[7]的方法，使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行。

1.3.2干重測(cè)量前，先將Whatman GF/C濾膜置于烘箱內(nèi)，干燥；再置于干燥皿中，濾膜冷卻之后，稱量濾膜重量(m1)；精確量取藻液V藻液，使用稱重后的濾膜進(jìn)行抽濾；將附著有藻細(xì)胞的濾膜再次置于烘箱內(nèi)，干燥；隨后將濾膜置于干燥皿中，待濾膜完全冷卻之后，對(duì)其進(jìn)行稱量(m2)。細(xì)胞干重

m=(m2-m1)×1000/V藻液

C2=C1×V2/V1

式中:C1表示上清液中葉綠素a的質(zhì)量濃度，g/L；C2表示藻液中葉綠素a質(zhì)量濃度，g/L；A666表示待測(cè)液中葉綠素a的吸光值；V1為藻液體積；V2為所用DMSO體積。

式中，C1表示上清液中蝦青素的濃度,g/L；C2表示藻液中蝦青素的濃度,g/L；A490表示待測(cè)液中蝦青素的吸光值；V1表示藻液體積；V2表示所用DMSO體積。

1.3.5蝦青素占干重體積分?jǐn)?shù)蝦青素占干重體積分?jǐn)?shù)為

1.4光化學(xué)效率及快速光響應(yīng)曲線測(cè)定

葉綠素?zé)晒鈪?shù)用可調(diào)制式熒光儀(PAM-WATER-ED, Walz，德國(guó))測(cè)定[10～11]。藻樣暗適應(yīng)4 min，最大飽和脈沖設(shè)為4 000 μmol/(m2·s)，光系統(tǒng)II的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)，非光化學(xué)淬滅(NPQ分別計(jì)算如下：

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm

NPQ=(Fm-Fm′)/Fm

Fm:熒光最大值，經(jīng)過(guò)暗適應(yīng)后，光合機(jī)構(gòu)中PSII的所有反應(yīng)中心呈現(xiàn)完全關(guān)閉狀態(tài)下的熒光強(qiáng)度，此時(shí)所有的非光化學(xué)途徑都處于最小。Fo：熒光初始值，經(jīng)過(guò)暗適應(yīng)后，光合機(jī)構(gòu)中PSII的所有反應(yīng)中心呈現(xiàn)完全開(kāi)放狀態(tài)下的熒光強(qiáng)度，這時(shí)所有的非光化學(xué)途徑都處于最小。

Fv：暗適應(yīng)之后,非光化學(xué)途徑都處于最小時(shí)的最大可變熒光，F(xiàn)v=Fm-Fo。

快速光響應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線(Rapid Light Curve，RLC)的測(cè)定，參考White等(1999)的方法[12]，設(shè)定的光強(qiáng)梯度為0、141、217、320、489、730、1037、1441、2362 μmol/(m2s)，光適應(yīng)時(shí)間設(shè)定為20 s。

1.5快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定(OJIP誘導(dǎo)曲線)

室溫下利用連續(xù)激發(fā)式熒光儀(Handy PEA，Hansatech，英國(guó))獲得葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線。藻樣暗適應(yīng)時(shí)間4 min后，用Handy PEA按時(shí)檢測(cè)記錄實(shí)驗(yàn)材料照射激發(fā)光后10 μs至2 s內(nèi)不同時(shí)間的熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)過(guò)一段時(shí)間暗適應(yīng)后，再經(jīng)過(guò)連續(xù)光照，葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度隨著光照時(shí)間變化的熒光曲線中的快相部分(時(shí)間為1 s左右)為OJIP誘導(dǎo)曲線。作圖時(shí)，為了方便觀察J點(diǎn)和P點(diǎn)變化，一般將橫坐標(biāo)(代表時(shí)間)改為對(duì)數(shù)坐標(biāo)，得到典型的OJIP誘導(dǎo)曲線。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用GraphPad Prism 5軟件作圖。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件分別進(jìn)行t檢驗(yàn)(P<0.05視為兩者差異顯著)。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1缺氮對(duì)血球藻生長(zhǎng)的影響

根據(jù)圖1的描述，血球藻在缺氮條件下，細(xì)胞分裂停止并且蝦青素開(kāi)始積累(圖1a、c、d)。接種后第3天，缺氮條件下藻細(xì)胞變成綠褐色不動(dòng)狀態(tài)，氮充足條件下藻細(xì)胞仍然是綠色游動(dòng)狀態(tài)；培養(yǎng)到第6 d，缺氮條件下藻細(xì)胞變?yōu)榧t色孢子狀態(tài)，氮充足條件下藻細(xì)胞仍然可以觀察到少量處于游動(dòng)狀態(tài)。相對(duì)于氮充足，在缺氮條件下血球藻葉綠素a幾乎不增長(zhǎng)(圖1b)。在全培養(yǎng)基的整個(gè)培養(yǎng)周期中,雨生紅球藻的生長(zhǎng)較好, 當(dāng)培養(yǎng)液中氮濃度逐漸消耗后, 所得到的最大細(xì)胞密度基本維持不變；缺氮時(shí), 細(xì)胞密度基本維持穩(wěn)定(圖1a)。而在缺氮條件下，蝦青素積累明顯增加。培養(yǎng)14 d后，氮充足條件下單位體積的蝦青素含量是缺氮條件下的1.84倍。缺氮條件下，細(xì)胞密度顯著低于全培養(yǎng)基處理組(P<0.05)，而缺氮條件下蝦青素比干重比值顯著高于全培養(yǎng)基處理組(P<0.05)。可以肯定的是，在缺氮這一單一因素影響下，擾亂了細(xì)胞的光合作用、呼吸以及代謝作用。因此，細(xì)胞分裂被抑制而且蝦青素合成被激發(fā)。

圖1　血球藻在缺氮和氮充足條件下生長(zhǎng)參數(shù)隨時(shí)間變化的曲線

2.2葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

圖2為在缺氮條件下血球藻4個(gè)不同生長(zhǎng)階段，葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化。 藻細(xì)胞光合作用活性可以通過(guò)葉綠素?zé)晒鈪?shù)反映出來(lái)，尤其是PSII最大光量子產(chǎn)量，即Fv/Fm，剛剛接種的對(duì)數(shù)期游動(dòng)綠細(xì)胞的Fv/Fm值最高，說(shuō)明綠色對(duì)數(shù)期藻細(xì)胞的PSII的最大光量子產(chǎn)量最大。血球藻生長(zhǎng)到紅色孢子時(shí)期時(shí)，其Fv/Fm值下降了約12%(圖2a)。在缺氮條件下，血球藻整個(gè)培養(yǎng)周期中，ΦFPSII和rETR參數(shù)呈現(xiàn)出同樣的下降趨勢(shì)，在綠褐色不動(dòng)細(xì)胞中達(dá)到最低，rETR下降了10%，隨后，rETR和Fv/Fm值均在紅色孢子中呈現(xiàn)上升趨勢(shì) (圖2a、d)。而NPQ表示的是非光化學(xué)猝滅，即PSII天線色素在光合作用過(guò)程中吸收的光能無(wú)法用于光合電子的傳遞而是通過(guò)熱耗散的方式最終消耗掉，NPQ值從綠色游動(dòng)細(xì)胞中的0.511上升到紅色孢子細(xì)胞中的0.824，并且在綠色不動(dòng)細(xì)胞和紅色孢子細(xì)胞中較高(圖2a)。

GV為綠色游動(dòng)細(xì)胞；GR為綠色不動(dòng)細(xì)胞；OR為綠褐色不動(dòng)細(xì)胞；RC為紅色孢子柱狀圖用平均值“±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示圖 2　血球藻在缺氮條件下不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞中葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

2.3快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線(OJIP)

為研究缺氮對(duì)血球藻PSII電子傳遞途徑的影響，選取整個(gè)培養(yǎng)周期的第0天及第14天測(cè)定氮充足及缺氮情況下的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線。如圖3所示，血球藻細(xì)胞呈現(xiàn)出來(lái)的快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線清晰反映出O、J、I、P相，與之前報(bào)道過(guò)的高等植物、藍(lán)藻及綠藻的快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線相似。O-J-I-P熒光瞬間升高是由于PSII電子受體池的連續(xù)還原以及PSII的反應(yīng)中心慢慢的關(guān)閉而導(dǎo)致的。J期被認(rèn)為是電子從QA-到QB的積累，I期反映了電子從QA到QB-積累，P期代表電子從QA-到QB2-的積累[13]。圖3顯示在第0 d和第14 d時(shí)，缺氮條件下藻細(xì)胞J點(diǎn)的相對(duì)可變熒光值都高于氮充足條件下的，而且在第14 d時(shí)，兩種不同條件處理下的J點(diǎn)的相對(duì)可變熒光值都有所升高，但與加入DCMU的缺氮對(duì)照組相比要低很多。而加DCMU的缺氮對(duì)照組由于阻止了電子從QA-到QB的傳遞，導(dǎo)致電子在QA-大量堆積，呈現(xiàn)出熒光從O到J點(diǎn)的迅速上升。

(a)第0 d

(b)第14 d圖 3　缺氮和氮充足條件下血球藻的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線

3討論

以上相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，缺氮嚴(yán)重影響血球藻細(xì)胞的正常生長(zhǎng)與光合作用。N源是血球藻生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在缺氮條件下血球藻的生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)小于氮充足條件下，蝦青素比干重比值雖增加，但是生物量卻增長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致單位體積蝦青素的增長(zhǎng)低于氮充足條件下的值。這一結(jié)果與苗鳳萍等學(xué)者[14]的研究結(jié)果基本相同。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)中快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線的研究，可以發(fā)現(xiàn)缺氮對(duì)血球藻PSII途徑的影響顯著。在缺氮條件下，血球藻的光合作用能力明顯受到影響，表現(xiàn)在光量子產(chǎn)量和電子傳遞速率下降等方面。由于缺氮導(dǎo)致藻細(xì)胞細(xì)胞代謝以及合成捕光色素所需要的酶合成不足，缺氮還會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞PSII反應(yīng)活性中心蛋白合成受阻，從而導(dǎo)致其PSII反應(yīng)活性中心受到嚴(yán)重?fù)p傷[15]。到培養(yǎng)后期，通過(guò)分析4種不同的狀態(tài)，血球藻光合作用能力的下降，表現(xiàn)在Fv/Fm值的下降，而非光化學(xué)猝滅NPQ明顯上升，說(shuō)明缺氮條件下血球藻光化學(xué)耗散下降，大部分過(guò)多的激發(fā)能耗散。而在紅色孢子細(xì)胞中，NPQ值要顯著高于綠色游動(dòng)細(xì)胞。正是由于其熱耗散能力較高，紅色孢子細(xì)胞對(duì)PSII的光合活性一定程度上起到了保護(hù)作用,跟研究報(bào)道的類胡蘿卜素含量與細(xì)胞的生理狀態(tài)和光化學(xué)活性有相關(guān)性的報(bào)道基本相符[16-17]。

綜上所述，缺氮能影響血球藻的PSII光化學(xué)反應(yīng)活性，影響蝦青素的產(chǎn)率，本研究為在缺氮條件下血球藻生長(zhǎng)規(guī)律提供一定的理論依據(jù)，為優(yōu)化生長(zhǎng)條件并提高蝦青素產(chǎn)率提供相關(guān)的參考信息。在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步觀察在不同脅迫條件下血球藻生長(zhǎng)、蝦青素積累及葉綠素?zé)晒庾兓?guī)律的情況。

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[責(zé)任編校： 張眾]

Effects of Nitrogen Deficiency on Haematococcus Pluvialis PhotosystemII Photochemical Changes and Changes of Astaxanthin

LI Jinxun1, XU Siyuan2, JIN Wei2

(1InstituteofLightIndustry,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China;2EnvironmentalManagementCollegeofChina,Qinhuangdao066000，China)

Abstract：Haematococcus pluvialis, as a freshwater unicellular green algae, consisting of considerable content of astaxanthin is the mainly natural materials for astaxanthin extraction. In this study, typical Haematococcus pluvialis named 192.80 was chosen to investigate the relationship between the variation of photosystem II (PSII) and the accumulation of astaxanthin under the condition of nitrogen starvation. The results shown that FPSII (Fv/Fm) decreased to the initial of 80%, then increased slowly, while rETR increased up to a maximum value and then decreased. Meanwhile, the results also indicated that either relative content of Chlorophyll, astaxanthin content or cell density under nitrogen starvation condition was significantly lower than that nitrogen sufficiency condition. On the contrary, the radio of astaxanthin and dry weight was obviously improved with the consumption of nitrogen nutrition, which represented the special protection mechanism of Haematococcus pluvialis for the response of nitrogen starvation.

Keywords：Haematococcus pluvialis; astaxanthin; PSII; Fv/Fm; nitrogen starvation

[收稿日期]2015-12-22

[基金項(xiàng)目]科技部863計(jì)劃(2014AA022000)

[作者簡(jiǎn)介]李金洵(1989-)， 女，湖北石首人，湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)工程與工藝

[文章編號(hào)]1003-4684(2016)02-00111-03

[中圖分類號(hào)]Q945

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]：A