李喜明，趙永騰，余旭亞

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650500)

化石能源日益短缺，溫室氣體效應(yīng)日趨嚴(yán)重，開發(fā)清潔可再生能源成為熱點(diǎn)，環(huán)境友好的生物柴油極具潛力[1]。作為制備生物柴油的原料，微藻因光合效率高、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、油脂含量高等特點(diǎn)，成為近些年來的研究熱點(diǎn)[2]。

培養(yǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)成分的改變，尤其在強(qiáng)光照、高溫、營(yíng)養(yǎng)成分缺乏等脅迫條件下，可直接影響微藻的生長(zhǎng)及油脂的合成[3-11]。此外，脅迫條件結(jié)合外源添加化學(xué)誘導(dǎo)物或植物激素，是有效促進(jìn)微藻細(xì)胞中油脂積累的另一工程策略[4,12]

褪黑素(melatonin，MT)是一種必需氨基酸——色氨酸的衍生物，最初發(fā)現(xiàn)于牛松果體中[13-14]。MT作為廣譜的抗氧化劑以及自由基清除劑，可直接淬滅植物中多余的活性氧(ROS)，以及通過提高細(xì)胞內(nèi)抗氧酶活性進(jìn)一步減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[15]。非生物脅迫條件下，MT作為調(diào)節(jié)劑，可以通過調(diào)節(jié)光合作用和新陳代謝影響植物的生長(zhǎng)和糖代謝[14]。WEEDA等[12]的研究結(jié)果表明，MT可通過參與細(xì)胞中赤霉素(GA)和脫落酸(ABA)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)植物抗衰老作用。此外，缺氮和高光照脅迫下，MT通過誘導(dǎo)一氧化氮水平調(diào)控促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)和環(huán)腺苷酸(cAMP)信號(hào)通路以激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子從而促進(jìn)與蝦青素和油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而提高微藻中次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累[16]；MT也可通過調(diào)控信號(hào)分子一氧化氮(NO)和水楊酸(SA)的水平來促進(jìn)雨生紅球藻中蝦青素的積累[17]。MT雖在植物功能調(diào)節(jié)方面已取得進(jìn)展，但其對(duì)微藻生長(zhǎng)及油脂合成的調(diào)節(jié)作用鮮有報(bào)道。

本文研究了MT誘導(dǎo)聯(lián)合缺氮脅迫培養(yǎng)對(duì)單針藻Monoraphidiumsp. QLY-1的生物量、油脂、碳水化合物、蛋白質(zhì)以及脂肪酸組成的影響，并考察了MT誘導(dǎo)下相關(guān)信號(hào)分子與油脂合成的關(guān)系。同時(shí)，探索了外源添加MT誘導(dǎo)油脂合成相關(guān)酶基因的表達(dá)與油脂積累的關(guān)系，旨在為研究微藻油脂積累提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單針藻Monoraphidiumsp. QLY-1篩選、保存于本實(shí)驗(yàn)室；褪黑素、ELISA試劑盒均購于上海生工生物工程有限公司；葡萄糖、三氯甲烷、甲醇均為分析純，購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-2012GZ恒溫(恒濕)振蕩搖床，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；TDL-40B高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FD5-12冷凍干燥機(jī)，美國金西盟國際集團(tuán)中國分公司；SmartSpec plus分光光度儀，上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，ABI-7500熒光定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司。

1.3 培養(yǎng)方式

異養(yǎng)培養(yǎng)：以BG-11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10 g/L葡萄糖，黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度(25±1)℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)周期10 d。

自養(yǎng)誘導(dǎo)：以缺氮BG-11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并設(shè)置為對(duì)照組，添加MT至終濃度達(dá)到1 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)處理[3]，光照100 μmol photons/(m2·s)下培養(yǎng),培養(yǎng)溫度(25±1)℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。每組設(shè)置3個(gè)平行。

1.4 生物量和油脂含量的測(cè)定

每天離心(3 500 r/min，10 min)收集藻細(xì)胞，記錄藻液體積(V，mL)，將濕藻體于-80 ℃下過夜后進(jìn)行真空冷凍干燥至恒重(W，g)。干藻粉(WD，g)∶石英砂(1∶2，質(zhì)量比)研磨20～30 min，以V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1，作為油脂提取溶劑，油脂提取采用具體操作步驟見ZHAO等[11]，并記錄油脂重量(WL，g)。

生物量/(g·L-1)=W/V×10-3

(1)

油脂含量/%=WL/WD×100

(2)

1.5 碳水化合物含量的測(cè)定方法

10 mg干藻粉置于15 mL離心管中，加入0.5 mL乙酸，80 ℃水浴20 min,再加入10 mL丙酮于離心管中，3 500 ×g，離心10 min。棄去上清液，收集藻細(xì)胞，吸取4 mol/L三氟乙酸2.5 mL重新懸浮，煮沸4 h，10 000 ×g，離心3 min，取100 μL上清液于新試管中，再加入900 μL硫酸(15 mL)∶水(7.5 mL)∶苯酚(0.15 g)，煮沸20 min。在490 nm處檢測(cè)其波長(zhǎng)，根據(jù)葡萄糖的含量與OD490nm的關(guān)系計(jì)算碳水化合物的含量[11]。

1.6 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法

稱取干藻粉10 mg于試管中，并加入NaOH溶液(1 mol/L)200 μL，80 ℃水浴10 min，加入800 μL蒸餾水，混合離心30 min，12 000×g，并將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，重復(fù)上述步驟提取2次，合并3次提取液，利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量[11]。

1.7 內(nèi)源性植物激素和關(guān)鍵酶基因的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取干藻粉0.1 g，按照質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶10加入勻漿介質(zhì)(磷酸緩沖液PBS，0.1 mol/L，pH 7.0～7.4)，冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿液，3 500×g，離心10 min。取上清液用生理鹽水按1∶9比例稀釋成10%體積分?jǐn)?shù)的組織勻漿進(jìn)行測(cè)定，利用ELISA試劑盒測(cè)定植物激素脫落酸ABA和赤霉素GA的含量。

利用Primer 5.0設(shè)計(jì)出相關(guān)酶基因的熒光定量特異性引物。由上海生工合成rbcL、accD、pepc(表1)，離心收集第1、第2、第3、第4天的藻細(xì)胞于2 mL離心管中，于-80 ℃冰箱保存，Trizol法提取藻細(xì)胞的總RNA，由逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

表1 單針藻Monoraphidium sp. QLY-1油脂合成相關(guān)酶基因的qRT-PCR引物Table 1 Gene involved in lipid biosynthetic pathway in and their respective primers used in qRT-PCR expression analysis

利用普通PCR實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證引物正確性。以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。梯度稀釋cDNA模板濃度用于制作熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的每個(gè)樣品各設(shè)置3個(gè)重復(fù)，本實(shí)驗(yàn)采用熒光染料SYBR進(jìn)行定量，隨著qRT-PCR的進(jìn)行，SYBR染料與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光信號(hào)由儀器檢測(cè)，從而達(dá)到定量的目的。熒光定量PCR條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火57 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)35。擴(kuò)增效率在90%～ 105%，R2>0.990為理想狀態(tài)，根據(jù)2-△△T法計(jì)算各基因的表達(dá)量，以此反映各基因的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都是通過ANOVA(SPSS 19.0)一步法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最小顯著差異進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)調(diào)查不同實(shí)驗(yàn)的組間差異，且當(dāng)*P<0.05具有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺氮條件下MT對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂含量的影響

如圖1-a所示，缺氮條件培養(yǎng)下，微藻生長(zhǎng)緩慢，最高生物量為0.89 g/L。MT進(jìn)行誘導(dǎo)后，最高生物量達(dá)到0.95 g/L，高于對(duì)照組，低于BG-11培養(yǎng)下的最高生物量(1.121 4 g/L)。這一結(jié)果表明添加外源MT可促進(jìn)微藻在缺氮培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)，這可能是由于MT提高了微藻利用細(xì)胞內(nèi)氮源的能力從而維持其在缺氮條件下的生長(zhǎng)[4]。

圖1 缺氮條件下MT對(duì)單針藻生物量(a)和油脂含量(b)的影響Fig.1 The effect of MT on the biomass production(a) and lipid content (b)of Monoraphidium sp. QLY-1 under the condition of nitrogen deficiency

BABU等[5]報(bào)道在小球藻中氮限制條件下聯(lián)合吲哚乙酸和胺鮮酯的誘導(dǎo)，微藻的生物量得以提高。這說明在缺氮脅迫或氮限制條件下，添加化學(xué)誘導(dǎo)子可有效提高微藻的生物量。

在缺氮條件培養(yǎng)下，微藻中的油脂含量最高為42.06%，高于BG-11培養(yǎng)下的最高油脂含量(33.77%)， MT進(jìn)行誘導(dǎo)后，微藻中的油脂含量比對(duì)照組提高了1.22倍(圖1)，且高于正常培養(yǎng)條件下褪黑素誘導(dǎo)單針藻的油脂含量(49.6%)[19]。這一結(jié)果表明，缺氮脅迫可有效提高微藻中油脂的含量，而MT可進(jìn)一步促進(jìn)缺氮條件下微藻中油脂的積累。這可能是因?yàn)橥庠刺砑拥腗T會(huì)強(qiáng)化微藻中蛋白質(zhì)、碳水化合物與油脂合成的內(nèi)在聯(lián)系， MT誘導(dǎo)和光誘導(dǎo)的聯(lián)合培養(yǎng)，可使微藻中蛋白質(zhì)和碳水化合物的含量發(fā)生改變進(jìn)而促進(jìn)油脂的積累[18]。因此，MT誘導(dǎo)缺氮脅迫下單針藻中油脂的積累可能與藻細(xì)胞中化合物之間的轉(zhuǎn)化有關(guān)。

圖2 缺氮條件下MT對(duì)單針藻中碳水化合物含量(a)和蛋白質(zhì)含量(b)的影響Fig.2 The effect of MT on the carbohydrate(a) and protein(b) content of Monoraphidium sp.QLY-1 under the condition of nitrogen deficiency

2.2 缺氮條件下MT對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1中碳水化合物含量和蛋白質(zhì)含量的影響

光合作用中所固定的碳可用于合成油脂，碳水化合物和蛋白質(zhì)等富含能量的物質(zhì)。圖2-a顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中微藻碳水化合物的含量呈下降趨勢(shì)。而碳水化合物是光合作用的初期產(chǎn)物，缺氮脅迫下碳水化合物含量降低，可能與油脂積累有關(guān)；外源添加MT誘導(dǎo)后，碳水化合物含量低于對(duì)照組，藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量顯著增加。在油脂大量合成階段，單針藻QLY-1細(xì)胞內(nèi)碳水化合物含量顯著降低，這一結(jié)果與 MILLER所報(bào)道的一致[20]。

在單針藻QLY-1生長(zhǎng)過程中，蛋白質(zhì)的含量呈先穩(wěn)定再下降的趨勢(shì)。異養(yǎng)小球藻接種于自養(yǎng)培養(yǎng)，蛋白質(zhì)含量在數(shù)小時(shí)內(nèi)迅速積累[21]。而在脅迫條件下，如高光照和缺氮，導(dǎo)致Nannochloropsisoceanica蛋白質(zhì)水平迅速下降[22]。外源添加MT使油脂積累增加，蛋白質(zhì)大量消耗，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量降低。CHOKSHI等[6]研究顯示，Acutodesmusdimorphus在缺氮脅迫下，其蛋白質(zhì)和碳水化合物含量均呈明顯下降趨勢(shì)。MT聯(lián)合缺氮脅迫條件下，單針藻QLY-1中碳水化合物含量和蛋白質(zhì)含量可能與油脂合成的復(fù)雜代謝過程相關(guān)聯(lián)，其內(nèi)在聯(lián)系及相關(guān)機(jī)制值得進(jìn)一步開展研究。

2.3 缺氮條件下MT對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1中植物激素含量的影響

脫落酸ABA和赤霉素GA，是植物和微藻中控制生物脅迫和非生物脅迫的兩種重要的植物激素和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[7-9,23]。缺氮脅迫下，微藻中ABA含量在第一天顯著增加，添加外源MT誘導(dǎo)后，ABA含量呈緩慢上升趨勢(shì)但低于對(duì)照組(圖3-a)。

圖3 缺氮下MT對(duì)單針藻中脫落酸ABA(a)和赤霉酸GA(b)含量的影響Fig.3 The effect of MT on abscisic acid (ABA) (a) and gibberellic acid (GA) (b) of Monoraphidium sp.QLY-1 under the condition of nitrogen deficiency

結(jié)果表明，MT促進(jìn)缺氮脅迫下微藻中ABA的分解代謝。SULOCHANA等[9]報(bào)道微藻Scenedesmusquadricauda在缺氮條件下，細(xì)胞內(nèi)ABA含量第1天顯著增加。此外，在缺氮脅迫下，GA含量數(shù)小時(shí)內(nèi)迅速增加，而后保持在13 μg/L上下，添加外源MT誘導(dǎo)后，GA含量呈上升趨勢(shì)(圖3-b)。這一結(jié)果表明，MT可促進(jìn)藻細(xì)胞內(nèi)GA的合成。ZHANG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，MT的作用主要是通過ABA和GA4的生物合成與分解代謝，從而緩解高鹽脅迫對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的作用。通過MT促進(jìn)缺氮脅迫下單針藻中油脂的積累，可能與其調(diào)控GA合成和ABA分解代謝相關(guān)，這一相關(guān)效應(yīng)的分子機(jī)制還有待研究和探索。

2.4 缺氮條件下MT對(duì)單針藻Monoraphidium sp. QLY-1中與油脂合成相關(guān)酶基因表達(dá)量的影響

通過上調(diào)油脂合成相關(guān)酶基因的表達(dá)可促進(jìn)單針藻中油脂的積累[18]。乙酰輔酶A羧化酶(ACC)作為油脂合成第一步中的關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，而accD是編碼乙酰輔酶A羧化酶的異側(cè)β單元的一段DNA序列[16,24]。在MT處理下，accD表達(dá)水平在誘導(dǎo)第2天和第4天時(shí)分別比對(duì)照組提高了1.98和1.75倍(圖4)，accD表達(dá)量的增加與微藻中油脂的積累一致(圖1-b)。黃腐酸誘導(dǎo)條件下，單針藻Monoraphidiumsp. FXY-10中的accD表達(dá)與油脂合成呈正相關(guān)[18]。此外，外源MT上調(diào)了rbcL的表達(dá)水平，較對(duì)照組提高了1.2倍，且藻細(xì)胞生物量出現(xiàn)了相應(yīng)的增加(圖1-a)，外源添加MT可能促進(jìn)了核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCO)對(duì)CO2的固定[24]。

圖4 缺氮下MT對(duì)單針藻內(nèi)基因相關(guān)表達(dá)量的影響Fig.4 The effect of MT on relative expression level of gene of Monoraphidium sp.QLY-1 under the condition of nitrogen deficiency

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是油脂積累合成途徑上的另一關(guān)鍵酶。缺氮聯(lián)合MT誘導(dǎo)下，pepc的表達(dá)水平低于對(duì)照組，說明MT可能抑制該酶催化磷酸烯醇式丙酮酸向草酰乙酸的轉(zhuǎn)化，從而使磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮方向轉(zhuǎn)化，此時(shí)，accD基因表達(dá)量隨之升高，進(jìn)而促進(jìn)油脂積累。FAN等[25]研究表明，缺氮脅迫下，微藻中pepc8086的表達(dá)水平在生長(zhǎng)階段末期增加了1.4倍，而在油脂積累極端呈下調(diào)趨勢(shì)。綜上，缺氮脅迫下，外源MT促進(jìn)單針藻中油脂的積累與上調(diào)accD、rbcL及下調(diào)pepc有關(guān)。這與之前李大菲等[19]利用褪黑素誘導(dǎo)單針藻中油脂積累的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本文研究MT聯(lián)合缺氮脅迫可以進(jìn)一步提高單針藻Monoraphidiumsp. QLY-1中的油脂含量，且比單一缺氮脅迫下提高了1.22倍。MT促進(jìn)微藻中油脂的積累與調(diào)控信號(hào)分子GA的合成及ABA的降解有關(guān)。MT顯著上調(diào)了accD和rbcL的表達(dá)水平，與微藻中油脂的合成呈正相關(guān)，同時(shí)下調(diào)了pepc的表達(dá)量。本研究初步闡明了缺氮聯(lián)合MT誘導(dǎo)微藻積累油脂的分子機(jī)制，為基因工程改造微藻提供了一定的理論基礎(chǔ)。MT與其他信號(hào)分子調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)缺氮脅迫下微藻油脂積累的相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。