王琪，劉聰，景彥萍，張敏，范三紅

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原，030006)

乳酸菌是發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的一大類(lèi)細(xì)菌。絕大部分乳酸菌是正常人、畜體內(nèi)極其重要的菌群，具有維持微生態(tài)平衡、提高免疫力、改善乳糖不耐癥等多種益生作用[1]，因此在食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用非常廣泛。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品是利用有益微生物發(fā)酵谷物、豆類(lèi)、乳、蔬菜及肉類(lèi)等制成的食品，如醪糟、酸奶、泡菜、發(fā)酵香腸等[2]。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的乳酸菌具有潛在的益生特性[3-6]。同時(shí)，隨著抗生素的廣泛使用，益生菌的耐藥性也越來(lái)越受到關(guān)注[7-8]。

晉西北酸粥是一種風(fēng)味獨(dú)特、酸香濃郁的傳統(tǒng)谷物發(fā)酵食品，它以糜米為主要原料，經(jīng)微生物自然發(fā)酵而成。本文對(duì)晉西北酸粥發(fā)酵液中的乳酸菌進(jìn)行了潛在益生特性和抗生素耐藥性的研究。這不僅可為晉西北酸粥的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)和菌株保障，同時(shí)也可為功能性益生菌劑的開(kāi)發(fā)及發(fā)酵食品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20株乳酸菌：本實(shí)驗(yàn)室從晉西北酸粥中分離并于-80 ℃保存于含保護(hù)劑的MRS培養(yǎng)基中；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(ATCC 25923)，購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理中心。

牛膽鹽、膽固醇、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、抗生素等，生工生物工程(上海)股份有限公司。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖20 g、K2HPO42 g、檸檬酸氫二銨2 g、乙酸鈉5 g、MgSO40.5 g、MnSO40.25 g、Tween-80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基：向1L MRS液體培養(yǎng)基中加20 g瓊脂，調(diào)pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

MRS-THIO液體培養(yǎng)基：向100 mL MRS液體培養(yǎng)基中加入0.2 g硫代乙醇酸鈉，待充分溶解后，用1 mol/L 乙酸調(diào)pH 6.5，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、XM- 30R立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HC- 2518高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Centrifuge 5430R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀，Gel Doc 2000 UV凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的配制

將活化后的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基中振蕩(150 r/min)傳代培養(yǎng)。將第3代培養(yǎng)物8 000×g離心10 min，取菌體沉淀用無(wú)菌PBS緩沖液(pH 6.5)洗滌3次后重懸，得到菌懸液。

1.3.2 菌株的耐酸能力測(cè)定[9]

取上述菌懸液，按φ=5%比例分別接種于pH值3.0和正常pH的MRS液體培養(yǎng)基中，混勻后于37 ℃厭氧培養(yǎng)。分別在接種后0 h和2.5 h取培養(yǎng)物，稀釋涂布MRS平板于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，按公式(1)計(jì)算存活率。

(1)

式中：N1和N2分別為菌株接入pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2.5 h和0 h后的活菌數(shù)。

選取存活率≥50%的菌株，接種到pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24～96 h，若液體培養(yǎng)基變混濁，則菌株耐酸。

1.3.3 菌株的耐膽鹽能力測(cè)定[10]

將活化后的菌株按φ=3%接種量分別接種于含0.3、0.5、0.7 g/100 mL牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，測(cè)定各菌液在560 nm的吸光度，以不添加牛膽鹽的培養(yǎng)物為對(duì)照。

1.3.4 菌株的疏水性測(cè)定[10]

將活化的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h，8 000 ×g離心10 min，沉淀用除氧無(wú)菌PBS緩沖液(pH 6.5)洗滌3次后重懸，并調(diào)整密度使其A560nm值為1。取該菌懸液各4 mL，分別加入0.8 mL的甲苯和十六烷作為吸附劑，渦旋振蕩，待靜置分層后，取下層水相，測(cè)定其A560nm值。以無(wú)菌PBS緩沖液作空白對(duì)照，按公式(2)計(jì)算疏水率。

(2)

式中：A0和A1分別為菌液與吸附劑混勻前和混勻后的吸光度。

1.3.5 菌株的體外降膽固醇能力測(cè)定

將活化后的菌株按φ=53%接種量分別接種于含0.01 g/100 mL膽固醇的MRS-THIO液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，8 000 ×g離心10 min，收集上清液。采用鄰苯二甲醛比色法[11]測(cè)定上清液中膽固醇含量，按公式(3)計(jì)算菌株的膽固醇降解率。

(3)

式中：A0和A1分別為未接菌的含膽固醇培養(yǎng)基和上清液在550 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.6 菌株的體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 無(wú)細(xì)胞提取液的制備

將活化好的菌株按φ=3%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，8 000 ×g離心10 min，收集菌體，用除氧無(wú)菌PBS緩沖液(pH 6.5)洗滌3次后重懸，調(diào)整菌體密度分別為108、109、1010CFU/mL，每100 mL分別添加0.1 g溶菌酶，37 ℃恒溫水浴30 min，冰浴超聲破碎菌體(800 W，超聲2 s，間隔2 s，共15 min)，于4 ℃、10 000 ×g離心20 min，上清液即為無(wú)細(xì)胞提取液，4 ℃保存待測(cè)。

1.3.6.2 菌株對(duì)過(guò)氧化氫的耐受性測(cè)定[5]

將活化好的菌株按φ=1%接種量分別接種于含不同濃度(0、0.4、0.7、1.0 mmol/L)過(guò)氧化氫和不含過(guò)氧化氫的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)8 h，8 000 ×g離心15 min，收集菌體，使用除氧無(wú)菌PBS緩沖液(pH 6.5)洗滌3次，并重懸，測(cè)定A600nm值。

1.3.6.3 菌株清除羥自由基(·OH)能力的測(cè)定[5]

取0.435 mmol/L的亮綠l mL，0.5 mmol/L的FeSO42 mL，3 g/100 mL的過(guò)氧化氫1.5 mL，1 mL不同菌懸液密度的無(wú)細(xì)胞提取液，混勻，37 ℃水浴20 min。8 000 ×g離心15 min，取上清液測(cè)定A624nm值。按公式(4)計(jì)算·OH清除率。

(4)

式中：A為無(wú)Fenton試劑、無(wú)樣品、有亮綠體系的A624nm值；A0為有Fenton試劑、無(wú)樣品、有亮綠體系的A624nm值；As為有Fenton試劑、有樣品、有亮綠體系的A624nm值。

1.3.6.4 菌株清除DPPH自由基能力的測(cè)定[12]

取1 mL不同菌懸液密度的菌液加入2 mL DPPH- 甲醇溶液(0.1 mmol/L)，混勻后室溫避光反應(yīng)30 min，8 000 ×g離心15 min，取上清液測(cè)定A517nm值，用無(wú)菌水空白調(diào)零?？瞻捉M以等體積甲醇代替DPPH溶液，對(duì)照組以等體積無(wú)菌水代替菌液。按公式(5)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(5)

式中：A、A0、As分別為空白組、對(duì)照組、樣品組的A517nm值。

1.3.7 乳酸菌16S rDNA序列的測(cè)定

用試劑盒分別提取每株菌的基因組DNA，經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物338F-806R擴(kuò)增V3～V4區(qū)序列。338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。反應(yīng)體系(50 μL)：2×Taq PCR Master Mix 25 μL；引物(20 mmol/L)各5 μL；模板2 μL；ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃保溫10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并提交序列至NCBI獲得接收號(hào)(accession number)。

1.3.8 藥物敏感性測(cè)定[13]

藥敏紙片的制備：將直徑為7 mm的圓形濾紙片完全吸附以下不同效價(jià)的抗生素，氨芐青霉素、鏈霉素、氨芐西林均為10 μg，紅霉素15 μg，頭孢噻肟、氯霉素和四環(huán)素均為30 μg[14]。

采用藥物紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定菌株的藥敏性。將菌株分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h，離心收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水配成含菌數(shù)為107CFU/mL的菌懸液，取100 μL菌懸液均勻涂布于MRS平板，待平板表面干燥后將藥敏紙片貼于表面，每個(gè)平板內(nèi)等間距放置3張含有同種抗生素的紙片，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈的直徑。重復(fù)3次取平均值。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌，結(jié)果參照WHO提供的NCCLS最新版本的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0軟件利用Ducan多重比較法進(jìn)行差異顯著性比較，以P<0.05表示組間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的耐酸能力

作為益生菌的首要條件是能耐受胃酸[9]。人體胃液的pH值通常小于2，飯后被稀釋上升至3.5左右，食物通過(guò)胃的時(shí)間為1～2 h[9]。由圖1可知，在pH值為3.0的條件下培養(yǎng)2.5 h后，存活率大于50%的菌有14株；其中M-8、M-9、M-10、M-12、M-13和M-15的存活率超過(guò)100%。張和平等[15]發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古酸馬奶中的LactobacilluscaseiZhang和LactobacillusacidophilusZL12- 1在pH值3.0培養(yǎng)3 h后的存活率達(dá)50%。

將上述存活率≥50%的菌在pH值為3.0的MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24～96 h后以下14株菌可以生長(zhǎng)：M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-8、M-9、M-10、M-12、M-13、M-15、M-16、M-17和M-19。張和平等[15]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳中的干酪乳桿菌在pH值為2.0～5.0的人工胃液中3 h后存活不受影響。

圖1 菌株在pH 3.0的MRS液體培養(yǎng)基中2.5 h后的存活率Fig.1 The survival rate of strains after 2.5 h in MRS liquid medium of pH 3.0

2.2 菌株的耐膽鹽能力

益生菌必須能耐膽鹽[9]。盡管目前沒(méi)有確定益生菌能耐受的腸道膽鹽的最高濃度，但篩選能耐受高濃度膽鹽的菌株卻是非常必要的[16]。由表1可知，不同乳酸菌在不同膽鹽濃度下的生長(zhǎng)情況各異；隨著膽鹽濃度的升高，菌株生長(zhǎng)變慢；在相同膽鹽濃度下，各菌株的生長(zhǎng)存在顯著性差異(P<0.05)； M-1、M-5、M-7、M-8、M-9、M-10和M-13對(duì)膽鹽的耐受性較強(qiáng)。

表1 不同膽鹽質(zhì)量濃度下菌株的生長(zhǎng)情況Table 1 Tolerance of the strains to bile salts of different concentrations

注：同列帶不同小寫(xiě)字母的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

其中，M-5在含0.7 g/100 mL膽鹽的培養(yǎng)基中仍能生長(zhǎng)。王立平等[17]從蒙古酸馬奶中篩出的嗜酸乳桿菌能耐受膽鹽的最大濃度為0.6 g/100 mL，張和平等[15]從內(nèi)蒙古酸馬奶中分離的干酪乳桿菌能耐受膽鹽的最大濃度為1.6 g/100 mL。

2.3 菌株的疏水性

黏附是益生菌在人體消化道內(nèi)定植并發(fā)揮作用的基礎(chǔ)[18]。菌體的表面疏水性能反映其黏附力，疏水性越強(qiáng)，黏附力越強(qiáng)。由圖2可知，20株乳酸菌對(duì)甲苯和十六烷的黏附能力不同；M-5、M-10、M-17和M-19對(duì)甲苯和十六烷的吸附力較強(qiáng)，其中最強(qiáng)的是M-19，對(duì)甲苯和十六烷的疏水率分別為15.44%和16.42%。這與文獻(xiàn)中報(bào)道的疏水率還有一定的距離[19-20]。

圖2 菌株的疏水性比較Fig.2 Comparison of the hydrophobicity of the strains

2.4 菌株的體外降膽固醇能力

過(guò)量膽固醇與心腦血管疾病密切相關(guān)[20]。由圖3可知，有12株菌對(duì)膽固醇的降解率超過(guò)50%；其中M-10的降解率最高(84.11%)。這遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)中的結(jié)果，L.caseiZhang的降解率為49.61%[15]，嗜酸乳桿菌的降解率為50%[17]。

圖3 菌株的體外降膽固醇能力比較Fig.3 Comparison of the cholesterol-reducing ability in vitro of strains

2.5 菌株的體外抗氧化活性

對(duì)H2O2的耐受性是評(píng)價(jià)抗氧化性的重要指標(biāo)。由表2可知，隨著H2O2濃度的升高，菌株的耐受性降低；在相同的H2O2濃度下，各菌株的耐受性存在顯著性差異(P<0.05)；其中M-4、M-1和M-8的耐受性較強(qiáng)。侯保朝等[21]發(fā)現(xiàn)乳酸菌SC608能耐受的H2O2濃度為1 mmol/L。

表2 不同H2O2濃度下菌株的生長(zhǎng)情況Table 2 Tolerance of the strains to hydrogen peroxide of different concentrations

注：同列帶不同小寫(xiě)字母的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

羥自由基(·OH)是最主要的導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的自由基[22]。對(duì)(·OH)的清除力也是反映菌株抗氧化能力的重要參數(shù)。由圖4可知，20株乳酸菌都有一定的(·OH)清除力；隨著菌液密度的增加，清除率不斷提高；其中M-20在菌液密度為1010CFU/mL時(shí)的清除率最高(33.07%)。這遠(yuǎn)高于王曦等[23]、劉洋等[24]報(bào)道的乳酸菌的清除率，但是低于蔣琰潔等[25]測(cè)定的面包乳桿菌的清除率(48%)，遠(yuǎn)低于王剛等[26]研究的植物乳桿菌和干酪乳桿菌的清除率(分別為83%和95%)。

圖4 菌株對(duì)(·OH)的清除能力比較Fig.4 Comparison of the strains for scavenging activities on hydroxyl radicals

對(duì)DPPH自由基的清除效果也是評(píng)價(jià)菌株抗氧化性的重要指標(biāo)[27]。由圖5可知，20株乳酸菌對(duì)DPPH自由基的清除能力差別很大；隨著菌液密度的增加，清除能力不斷提高；在菌液密度為1010CFU/mL時(shí)，有10株菌對(duì)DPPH自由基的清除率大于50%，其中M-16的清除率最高(84.65%)。這遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)中的結(jié)果[24-25, 28-30]，而稍低于王曦等[23]報(bào)道的結(jié)果(98.15%)。

圖5 菌株DPPH自由基清除能力的比較Fig.5 Comparisons of the strains for scavenging effects on DPPH free radicals

綜合上述3個(gè)抗氧化性指標(biāo)，得出M-8的抗氧化能力較強(qiáng)。

總之，對(duì)于20株乳酸菌首先從耐酸性篩選到存活率大于50%的14株菌，接著對(duì)這14株菌進(jìn)行耐膽鹽和疏水性篩選后剩余9株菌，再對(duì)這9株菌進(jìn)行降膽固醇和抗氧化性篩選后剩余4株菌。需要特別說(shuō)明的是，M-15的降膽固醇能力非常強(qiáng)，而且對(duì)·OH的清除率很高；雖然其耐膽鹽能力相對(duì)而言最弱，但是其耐膽鹽能力的絕對(duì)值并不低，且它能在膽鹽環(huán)境中生長(zhǎng)，只是速度慢些，故也被選中。因此，具有潛在益生特性的5株菌是：M-1、M-5、M-8、M-10和M-15。

2.6 菌株16S rDNA序列分析

對(duì)上述5株益生菌提取基因組DNA后進(jìn)行16S rDNA V3-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)在約500 bp處有較濃的單一條帶，符合理論值(圖6)。這5株菌的16S rDNA序列均與短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)的同源性為99%(表3)。結(jié)合前期的形態(tài)觀察、生理生化特征，將這5株菌均鑒定為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，NCBI接收號(hào)為MG722897-MG722901。

Mr：100 bp DNA ladder marker；Lane 1：M-1；Lane 2：M-5；Lane 3：M-8；Lane 4： M-10；Lane 5：M-15圖6 五株菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoresis analysis of 16S rDNA amplification products of five strains

表3 五株菌的16S rDNA序列的比對(duì)結(jié)果Table 3 Blast results of 5 strains by 16S rDNA sequences

2.7 乳酸菌的藥敏性分析

通過(guò)對(duì)益生菌進(jìn)行藥敏性測(cè)定，可避免耐藥基因由于益生菌的廣泛使用而傳播。由表4可知，5株益生菌對(duì)不同抗生素的耐藥性不同；對(duì)青霉素、頭孢噻肟、四環(huán)素和鏈霉素均有耐藥性，這與凡琴等[31]的結(jié)果相似；對(duì)氨芐西林、紅霉素和氯霉素均敏感，且敏感度不同，這與楊吉霞等[13]的結(jié)果一致。

表4 五株菌對(duì)抗生素的耐藥性Table 4 Antibiotic resistance of 5 strains

注：S-敏感；I-中度敏感；R-耐藥。

3 結(jié)論

本文研究了20株乳酸菌的潛在益生特性和藥敏性。菌株M-8、M-9、M-10、M-12、M-13和M-15的體外耐酸性非常強(qiáng)；M-1、M-5、M-8、M-9、M-10和M-13對(duì)膽鹽的耐受性較強(qiáng)；M-19的疏水性最強(qiáng)；有12株菌對(duì)膽固醇的降解率大于50%；M-1、M-4和M-8對(duì)H2O2的耐受性較好，M-12和M-20對(duì)(·OH)的清除率最高，M-5和M-1對(duì)DPPH自由基的清除率最高。綜上，M-1、M-5、M-8、M-10和M-15具有潛在益生特性，均為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)。這5株菌對(duì)青霉素、頭孢噻肟、四環(huán)素和鏈霉素耐藥，對(duì)氨芐西林、紅霉素和氯霉素敏感。