郭鳳柱，譚之磊，時(shí)藝翡，宋富，鐘其頂，賈士儒*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)3(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

ε-聚-L-賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是目前從自然界中已發(fā)現(xiàn)的兩種氨基酸同聚物之一，它是由微生物代謝合成的(主要為放線菌[1]，另外個(gè)別細(xì)菌也可以合成[2])含有25～35個(gè)L-氨基酸殘基的同聚氨基酸，這些L-賴氨酸(L-Lys)殘基通過(guò)α-羧基和ε-氨基連接[3-4]。因其具有安全性高[5]、抑菌譜廣[6-8]、水溶性好和熱穩(wěn)定性強(qiáng)[9-10]等特性，ε-PL已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)和生物材料等領(lǐng)域[11-17]。我國(guó)于2014年4月批準(zhǔn)了ε-聚賴氨酸及其鹽酸鹽作為食品添加劑新品種[18]。為了適應(yīng)ε-PL在食品應(yīng)用方面需求量的增大，許多研究者已投入到旨在提高ε-PL產(chǎn)量的研究中。但由于ε-PL的生物合成及整體調(diào)控機(jī)制尚不十分明確[19]，因此，對(duì)其生物合成過(guò)程中的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定量分析是十分必要的。

13C同位素示蹤技術(shù)作為代謝流分析的方法之一，因其可以準(zhǔn)確、快速、直觀的反應(yīng)代謝流向和流量，受到越來(lái)越多科研人員的青睞。13C同位素示蹤研究中，由于中間代謝物反應(yīng)速度快、濃度低、難以及時(shí)定量分析，而菌體蛋白氨基酸作為菌體的重要組成成分，并與產(chǎn)物前體之間有著很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此，可以根據(jù)菌體蛋白水解氨基酸的標(biāo)記信息來(lái)推測(cè)胞內(nèi)代謝物的標(biāo)記信息，進(jìn)而根據(jù)胞內(nèi)標(biāo)記代謝物的平衡和代謝網(wǎng)絡(luò)的化學(xué)計(jì)量關(guān)系進(jìn)行代謝通量分析[20]。所以，菌體蛋白水解氨基酸的分離提取是開(kāi)展13C穩(wěn)定同位素示蹤研究的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。鐘其頂?shù)炔捎玫捣ǔ晒χ苽淞酸劸平湍妇w蛋白氨基酸[21]；申鐵[22]、ZAMBONI等[23]采用高溫(100 ℃)干燥法對(duì)大腸桿菌菌體蛋白氨基酸進(jìn)行了分離；但是關(guān)于鏈霉菌菌體蛋白氨基酸的分離制備目前鮮有報(bào)道。因此，通過(guò)采用不同預(yù)處理手段，對(duì)酸水解后的菌體氨基酸進(jìn)行干燥，以探索不同干燥方法對(duì)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌菌體蛋白氨基酸分離鑒定的影響，并建立高效的菌體蛋白氨基酸制備方法，為今后實(shí)施13C穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)在鏈霉菌中的應(yīng)用，揭示ε-PL發(fā)酵過(guò)程的代謝機(jī)理提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基

淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(StreptomycesdiastatochromogenesCGMCC3145)，由天津科技大學(xué)從海南島土壤樣品中分離篩選獲得，現(xiàn)保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)。

斜面固體培養(yǎng)基(Bennett’s，g/L)：葡萄糖 10，牛肉膏 1，蛋白胨 2，酵母浸粉 1，瓊脂 15～20，2 mol/L NaOH調(diào)pH 7.7，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

種子/發(fā)酵培養(yǎng)基(M3G，g/L)：葡萄糖 50，酵母浸粉 5，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO41.36，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，氨水調(diào)pH 7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.2 試劑

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich公司，美國(guó))；無(wú)水葡萄糖(Solarbio公司，中國(guó))；N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA≥95%，Sigma-Aldrich公司，瑞士)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，色譜純，Adamas公司，中國(guó))；HCl(優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)等。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5795C氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國(guó)Agilent Technologies；HYG-Ⅱ迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床，上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；LRH-100-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；5804R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；FD-1真空冷凍干燥機(jī)，上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；HN 200多功能氮吹儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；GZX-9070 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠等。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將保藏菌種接至Bennett’s固體斜面，30 ℃，濕度50%的條件下恒溫恒濕培養(yǎng)5～7 d，直至長(zhǎng)滿孢子，置于4 ℃冰箱中保存待用。

從孢子斜面挑一環(huán)孢子接于含有100 mL M3G液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)30 h。

將種子液以6%接種量接于含有100 mL M3G液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)。隔一定時(shí)間取樣，確定發(fā)酵液中的菌體生長(zhǎng)。

1.3.2 樣品處理方法

取對(duì)數(shù)中后期發(fā)酵液，4 ℃ 1 2000×g離心5 min，收集菌體；將菌體用無(wú)菌水洗2次，取約100 mg濕菌體于15 mL離心管中，加入4 mL的6 mol/L鹽酸后在85 ℃下水解24 h[24]，水解液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后獲得淡黃色氨基酸液體，分別取50 μL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液、菌體水解液于1.5 mL新的EP管中，樣品分別進(jìn)行真空冷凍干燥、氮吹儀40 ℃吹干、烘箱95 ℃烘干。最終得到黃色氨基酸晶體。

1.3.3 氨基酸的衍生

加入100 μL DMF輔助衍生試劑，振蕩混勻，然后加100 μL MTBSTFA衍生試劑，再次震蕩混勻，80 ℃衍生反應(yīng)60 min，反應(yīng)完成后冷卻至室溫，離心取上清，待進(jìn)入GC-MS檢測(cè)[21,23]。

1.3.4 氨基酸的測(cè)定

色譜條件：HP-5色譜柱，載氣為氦氣，柱流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?20 ℃，保持2 min，以3.0 ℃/min升溫至250 ℃，再以10 ℃/min升溫至270 ℃保留10 min；進(jìn)樣體積1 μL，分流比10∶1[21,23]。

1.3.5 生物量的測(cè)定

將化學(xué)分析濾紙編號(hào)，95 ℃烘干至恒重，稱量，備用。吸取4 mL發(fā)酵液，6 000×g離心10 min，棄掉上清液。將菌體沖洗至濾紙上，并用適量去離子水洗滌2～3次，95 ℃烘干至恒重，稱量，計(jì)算生物量(biomass, g/L)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體蛋白氨基酸制備取樣點(diǎn)的確定

根據(jù)方法1.2.1，菌株S.diastatochromogenesCGMCC3145種子培養(yǎng)30 h后，以6%接種量轉(zhuǎn)接至M3G發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔4 h取樣分析其生物量的變化，菌株CGMCC3145的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。在菌體生長(zhǎng)的指數(shù)中后期，其細(xì)胞內(nèi)代謝系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[11]，所以選取24 h作為菌體氨基酸制備的取樣點(diǎn)。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基中菌株CGMCC3145的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of strain S. diastatochromogenes CGMCC3145 cultivated in fermentation medium

2.2 氨基酸標(biāo)品的測(cè)定

對(duì)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品采用不同干燥方法處理后，經(jīng)衍生化，進(jìn)行GC-MS分析，由圖2總離子流圖中峰的定性分析可知：(1)標(biāo)準(zhǔn)品中16種氨基酸均能被檢測(cè)(僅烘干法中鳥(niǎo)氨酸未檢出)；(2)出峰順序依次為：丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、鳥(niǎo)氨酸(精氨酸)、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸；(3)各氨基酸的分離效果較好。

A-真空冷凍干燥法；B-氮吹法；C-烘干法圖2 不同干燥處理方法下氨基酸標(biāo)品的氣相色譜圖Fig.2 The GC chromatogram of amino acid standards with different drying treatment

2.3 菌體蛋白氨基酸的測(cè)定

同樣，菌株S.diastatochromogenesCGMCC3145菌體蛋白氨基酸采用不同干燥方法處理后，再經(jīng)衍生化，進(jìn)行GC-MS分析，總離子流圖結(jié)果如圖3所示(各個(gè)菌體蛋白氨基酸保留時(shí)間與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間基本一致)。由于菌體蛋白鹽酸水解過(guò)程中，天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸，谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，色氨酸、半胱氨酸被破壞。因此，最多可檢測(cè)出16種氨基酸。通過(guò)對(duì)總離子流圖中峰的定性分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)真空冷凍干燥處理后(圖3-A)，檢測(cè)到16種氨基酸；采用氮吹法處理后(圖3-B)，檢測(cè)到14種氨基酸，相較于真空冷凍干燥法，并未有鳥(niǎo)氨酸、組氨酸檢出；采用烘干法處理后(圖3-C)，共有15種氨基酸檢出，相較于真空冷凍干燥法，鳥(niǎo)氨酸未檢出。這可能是由于鳥(niǎo)氨酸在樣品中本身含量極低(由表1可知)，且經(jīng)氮吹法或烘干法處理后，受氨基酸熱降解影響進(jìn)而無(wú)法被檢出。

A-真空冷凍干燥法；B-氮吹法；C-烘干法圖3 不同干燥處理方法下菌體蛋白氨基酸的氣相色譜圖Fig.3 The GC chromatogram of protein-bound amino acids with different drying treatment

表1 不同預(yù)處理方式對(duì)獲得菌體蛋白氨基酸種類及含量的影響Table 1 The effect of different pretreatment on protein-bound amino acids

注：“-”表示未檢出。

進(jìn)一步對(duì)不同處理方式下菌體蛋白氨基酸的GC-MS譜圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)于同一氨基酸而言，不同的預(yù)處理方法對(duì)其含量有顯著影響，以L-Alanine為例：使用真空冷凍干燥法檢測(cè)的L-Alanine含量分別是使用烘干法和氮吹法檢測(cè)含量的1.46倍和1.86倍；而對(duì)于相對(duì)含量較少且對(duì)溫度敏感的組氨酸[25]而言，使用真空冷凍干燥法檢測(cè)的含量是使用烘干法檢測(cè)含量的11.65倍，氮吹法處理組則未檢出組氨酸，這可能是由于氮吹法干燥過(guò)程較為迅速且通過(guò)氮?dú)鈱?duì)受熱樣品進(jìn)行吹掃增大了樣品受熱面積從而加劇了組氨酸熱降解。而在代謝通量分析中，胞內(nèi)代謝物的標(biāo)記信息是根據(jù)菌體蛋白氨基酸的標(biāo)記信息推測(cè)的[20,23,26]，因此，選取真空冷凍干燥法作為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌菌體蛋白氨基酸制備的方法。

3 結(jié)論

對(duì)菌體蛋白水解氨基酸分別用不同的處理方法進(jìn)行干燥處理，無(wú)論從氨基酸檢出的種類還是從氨基酸檢出的峰面積(含量)角度考慮，真空冷凍干燥的方法均優(yōu)于其余2種方法。本文建立了淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中菌體蛋白氨基酸的制備方法，為今后開(kāi)展13C同位素代謝通量分析、深入了解淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中心碳代謝途徑中的通量分布，對(duì)生產(chǎn)菌株合理的代謝改造提供了技術(shù)保障。