李雙，涂宗財，陳雪嵐

(江西師范大學 生命科學學院，江西 南昌，330022)

明膠是一種無脂肪的高蛋白，不含膽固醇的天然營養(yǎng)型食品添加劑。明膠作為一種強有力的保護膠體，具有較強的乳化力，能有效抑制牛奶、豆?jié){等蛋白質(zhì)進入胃后因胃酸作用而引起的凝聚反應，有利于提高食物消化能力。除了在食品領域具有廣泛應用外，明膠在醫(yī)藥、化妝品、照相等領域因其具有良好的凝膠性、成膜性、持水性及起泡性等特點亦發(fā)揮著特殊的功能。目前，工業(yè)上應用的明膠大部分來源于哺乳動物，如豬皮、牛皮、豬骨、牛骨等。但近年瘋牛病和口蹄病等哺乳動物傳染疾病的肆意傳播，導致哺乳動物明膠的安全性受到廣大消費者的普遍質(zhì)疑；另因宗教信仰(如伊斯蘭教、印度教飲食禁忌)等原因使得哺乳動物明膠在某些食品中的應用亦受到一定限制。

因此開發(fā)非哺乳動物來源的明膠具有重要的現(xiàn)實意義。隨著魚類直接食用和加工量的不斷增加，尤其是我國淡水水產(chǎn)品產(chǎn)量居世界第一，其加工過程中產(chǎn)生了大量的廢棄物—皮、骨、鱗，而這些廢棄物實際上含有大量的膠原蛋白，可作為明膠的主要來源，因此近年對其的深加工研究受到越來越多的科技工作者關注。

雖然近幾十年來魚明膠的研究非常普遍，但由于其產(chǎn)量和品質(zhì)的關系使其還不能完全替代哺乳動物明膠，提高魚明膠的產(chǎn)量和品質(zhì)是擴大其應用前景的重要研究方向。魚明膠的產(chǎn)量和品質(zhì)受原材料及其保存方式、提取方法、提取溫度及提取時間等因素的影響。傳統(tǒng)上，魚明膠的提取步驟一般分為四步：(1)除去原材料中非膠原蛋白雜質(zhì)；(2)預處理使膠原蛋白溶脹，提高提取效率；(3)熱水解萃取明膠；(4)將所得明膠干燥、保存[1]。魚明膠按其預處理方式不同分為2種提取方法，即化學提取法(酸堿試劑)和酶法?；瘜W提取法即用酸或堿試劑破壞魚膠原蛋白的非共價鍵，隨后熱激使膠原的三股螺旋結構發(fā)生紊亂導致螺旋-線圈結構的轉(zhuǎn)變，斷裂氫鍵和共價鍵，使其轉(zhuǎn)化為可溶性膠原。膠原的膨脹和溶解與酸堿的類型和濃度極其相關，會導致所得明膠的分子質(zhì)量分布不同，影響明膠的品質(zhì)；該法還存在生產(chǎn)周期過長、酸堿殘留等缺陷。酶法即用蛋白水解酶(如中性蛋白酶、胃蛋白酶和膠原酶等)提取明膠，酶法克服了酸堿的類型和濃度的局限性，且具有生產(chǎn)周期短、提取量高、污染少等優(yōu)點；但存在常用的酶的專一性不夠高且可能會產(chǎn)生苦味肽的問題。采用以上傳統(tǒng)方式獲得的魚明膠與哺乳動物明膠相比其流變學性質(zhì)、凝膠強度等品質(zhì)都較低，導致其市場需求較低。若想擴大魚明膠的應用，急需對魚明膠傳統(tǒng)提取方法進行創(chuàng)新以提高魚明膠的品質(zhì)。近年來，相關科研工作者研究了不同來源的魚明膠的特點及不同保存方法對其品質(zhì)的影響；優(yōu)化魚明膠提取時間、溫度；外添加糖和鹽、用酶抑制劑結合蛋白酶處理提高明膠品質(zhì)等方法；并在傳統(tǒng)預處理方法上進行革新，如用超聲波、高壓輔助酸堿試劑提取明膠及酶修飾等方式提高產(chǎn)量的同時獲得更好品質(zhì)的魚明膠。

本文對影響魚明膠產(chǎn)量和品質(zhì)的因素、提取條件的優(yōu)化和提取方法的革新進行了總結，以期為相關科研工作者進一步提高魚明膠產(chǎn)量及其品質(zhì)、擴大魚明膠的應用前景提供參考和理論依據(jù)。

1 影響明膠產(chǎn)量和品質(zhì)的因素

1.1 魚類的來源對明膠產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

魚類的生長環(huán)境會影響魚類體內(nèi)氨基酸分布、膠原蛋白結構等從而影響魚明膠的產(chǎn)量和品質(zhì)。GMEZ-GUILLéN等[2]研究了不同生活環(huán)境的海洋生物：溫帶海域的比目魚類(Lepidorhombusboscii、Soleavulgaris、Gadusmorhua)、冷水魚鱈魚(MerlucciusmerlucciusL.)和無脊椎動物魷魚(Dosidicusgigas)中提取明膠并研究了凝膠性質(zhì)。結果發(fā)現(xiàn)，同在45 ℃提取明膠時，其產(chǎn)率分別為：8.3%～7.4%、7.2%～6.5%和0。魷魚在45 ℃時沒有提取到明膠，當溫度升至80 ℃其產(chǎn)量也只有2.6%，究其原因是魷魚膠原蛋白的溶解度很低，導致明膠難以提取且提取到的明膠凝膠強度最低。

凝膠強度是由氨基酸的組成及α-鏈、β-鏈的含量共同確定的復雜功能，是明膠最重要的功能性質(zhì)之一。復性明膠中三螺旋結構的穩(wěn)定性與吡咯烷亞氨酸的總含量成正比，因為它最有可能在成核區(qū)域中形成脯氨酸和羥脯氨酸富集區(qū)域，羥脯氨酸含有-OH，丙氨酸和脯氨酸通常以Gly-pro-Y的形式存在于非極性區(qū)，這對維持魚明膠的三螺旋結構有重要作用，且高含量的脯氨酸、羥脯氨酸和丙氨酸使明膠具有更高的粘彈性[3]。溫水魚中有高含量的α-鏈、丙氨酸及亞氨酸，故而具更高的凝膠強度和粘彈性，冷水魚則相反。分析魷魚明膠組成發(fā)現(xiàn)其羥脯氨酸的含量最高，但凝膠強度最低，其原因可能是80 ℃高溫提取破壞了α-鏈，同時魷魚中丙氨酸的含量非常低，會表現(xiàn)出一定的疏水性，且其賴氨酸羥基化水平非常高，而羥賴氨酸氧化脫氨的-NH2基團會穩(wěn)定共價交聯(lián)作用，導致明膠提取量低，這正是低溶性膠原的特點。

魚明膠的凝膠性能很大程度受原材料的來源和種類影響，這與不同物種膠原中脯氨酸和羥脯氨酸含量差異有關。冷水魚皮膚的明膠由于其亞胺酸含量和脯氨酸羥基化程度相對低，其熱收縮性、變性溫度和明膠的熔融溫度明顯低于溫血動物和生活在溫暖水域中的魚類[2]。溫水魚皮膚結構復雜，纖維狀纖維強，耐高溫環(huán)境，因此需要更苛刻的提取條件才能獲得更高的產(chǎn)量；但其擁有更高的熔融溫度，凝膠會保持更長的時間，添加至食品中可提供更好的口感。因此，要根據(jù)不同來源的魚類的特點決定采用何種方法進行提取及通過魚類來源判斷可能獲得的魚明膠產(chǎn)量和品質(zhì)。這可為生產(chǎn)實踐提供指導。

1.2 不同保存方法對魚明膠品性的影響

目前，魚明膠原材料的保存方法一般為冷凍和干燥法。冷凍的溫度、干燥的方式都對魚明膠的品質(zhì)產(chǎn)生影響。FERNNDEZ-DAZ[4]比較研究了-12 ℃、-20 ℃冷凍保存方法對比目魚魚皮明膠品性影響，發(fā)現(xiàn)冷凍(-12和-20 ℃)保存的魚明膠中的α-鏈含量非常高，但β-及γ-鏈的含量很低，推測冷凍過程中形成的冰晶會損傷組織，且冷凍會誘導蛋白質(zhì)聚合，形成更多共價交聯(lián)的膠原蛋白，使β-和γ-鏈以及高分子質(zhì)量聚合物的溶解和提取變得更困難，而小的膠原蛋白組分提取更容易。以上結果表明，冷凍保存的明膠各方面的品質(zhì)，包括凝膠溫度及融膠溫度等都相對較差，不適合作為魚明膠原材料的保存方法。

為尋找較理想的魚皮明膠原材料的保存方法，LIU等[5]比較了新鮮、干燥和冷凍(-18 ℃，3個月)3種不同方法保存斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctaus)魚皮明膠對其品性的影響。實驗結果顯示3種明膠凝膠、融膠溫度沒有顯著差異，但SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)干燥魚皮明膠的α-鏈、β-鏈都顯著高于新鮮魚皮明膠。α-鏈(α-鏈之間的交聯(lián)比其他組分之間的交聯(lián)更穩(wěn)定)含量與凝膠強度之間存在線性關系，理論上干燥魚皮明膠含有更多α-鏈表明其具有更高的凝膠強度。實驗結果也顯示，3種不同方法保存的魚皮在10 ℃過夜成熟之后，干燥明膠凝膠強度最高，達到256g；而新鮮和冷凍保存法提取的明膠強度分別為243 g和246 g。說明工業(yè)上使用干燥法保存魚皮以提取明膠是切實可行的。

為探明不同干燥法對魚皮明膠品質(zhì)的影響，GIMéNEZ[6]采用不同干燥法對多佛比目魚(Soleavulgaris)皮明膠品性的影響進行了研究。干燥的方法分別是用乙醇、乙醇-甘油混合物和海鹽風干魚皮，并在室溫下保存160 d。在儲存期間定期提取明膠，根據(jù)分子質(zhì)量分布，黏彈性，膠凝和熔融溫度以及凝膠強度評價明膠品質(zhì)。結果顯示，所有的干燥保存法對所評價的明膠品質(zhì)幾乎相同，對分子質(zhì)量分布、黏彈性和凝膠強度沒有顯著影響；盡管干燥保存法使得所得明膠黏彈性、膠凝溫度和融點有輕微降低，但在整個儲存期間其大部分蛋白質(zhì)均保持穩(wěn)定，說明不同的干燥保存法幾乎不影響明膠的品質(zhì)。因此，干燥保存法是生產(chǎn)實踐中的首選方法，不僅成本相對低廉而且魚皮明膠的品質(zhì)保持良好。

1.3 提取溫度和時間對明膠產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

通常溫度提高和提取時間的延長有利于提高明膠的產(chǎn)量，原因是當施加較高的熱量時，天然膠原蛋白中的α-鏈之間的結合不穩(wěn)定，三螺旋結構變得無定形；增加提取時間亦提供了更多的能量來破壞鍵能，從皮膚中釋放更多游離的α-和β-鏈，使明膠更容易提取，獲得更高的產(chǎn)率。如SINTHUSAMRAN等[7]分別在45 ℃和55 ℃時用不同提取時間(3、6和12 h)提取石斑魚(Latescalcarifer)魚皮明膠，結果顯示溫度高、時間長回收率高，55 ℃明膠的回收率(62.0%～66.4%)顯著高于45 ℃的回收率(51.6%～57.3%)。點紋斑竹鯊和黑鰭鯊皮明膠[8]也有明膠產(chǎn)量隨著提取時間和溫度升高而提高的報道，但提取溫度的升高及時間的延長均對魚明膠的品性有影響。

明膠具有高含量的α-、β-和γ-鏈會擁有更好的功能特性，包括凝膠性、起泡性和乳化性[6]。SINTHUSAMRAN等[7]通過SDS-PAGE和顯微結構分析發(fā)現(xiàn)45 ℃提取3 h的明膠α-、β-和γ-鏈含量最高，明膠基質(zhì)緊密排列，形成了最好的凝膠網(wǎng)絡，故凝膠強度最好可達369 g，高于牛明膠的208 g。溫度的提高、提取時間的延長將導致明膠的α-、β-和γ-鏈含量下降，凝膠網(wǎng)絡松散，不利于凝膠強度。

明膠的凝膠時間與低分子質(zhì)量肽的含量相關，低分子質(zhì)量肽的含量越高，明膠的凝固時間越長。SINTHUSAMRAN等[7]在實驗中即發(fā)現(xiàn)55 ℃長時間提取的明膠需更長時間才能凝膠，而45 ℃較短時間提取的明膠凝膠時間短。此外，明膠的提取溫度和時間對明膠凝膠后的顏色也有影響，較高溫度特別是長時間的提取容易發(fā)生非酶促褐變反應。顏色差異小且明亮透明的明膠，更適合應用于食品等行業(yè)。

魚明膠熱提取過程中，提取時溫度和受熱時間的控制極為重要，雖然延長提取時間和提高提取溫度均有利于膠原蛋白的降解從而提高明膠產(chǎn)量，但提取溫度過高、時間過長會影響明膠中α-、β-和γ-鏈的含量及分布，影響明膠的品質(zhì)。溫和條件下提取的明膠品質(zhì)更好，更符合商業(yè)明膠的要求，但其產(chǎn)量較低。因此，提取魚明膠的溫度和時間要進行綜合考量。

1.4 紫外線對魚明膠品質(zhì)的影響

為延長魚明膠的保存時間，紫外線殺菌處理是一種常用的方法。BHAT等[9]研究其對魚明膠的影響時有意外的收獲：將魚明膠樣品(干顆粒)分別暴露于UV照射30和60 min，照射樣品的凝膠強度發(fā)生了顯著的改善(對照：177.8 g；照射30 min：198.1 g；照射60 min：234.0 g)。究其原因是紫外線處理會增加明膠分子間的交聯(lián)作用。紫外線處理可提高羅非魚和哺乳動物明膠凝膠強度亦有報道[10]。在明膠黏性方面，BHAT等[9]發(fā)現(xiàn)紫外光照射后的明膠粘性遠低于對照組(對照組：0.11 Pa·s；照射30 min：0.01 Pa·s；照射60 min：小于0.01 Pa·s)；在熱穩(wěn)定性方面，紫外照射后的凝膠溫度和融膠溫度都沒有顯著變化，但熔化焓值顯著增加，這種增加可能歸因于UV誘導明膠交聯(lián)，導致凝膠網(wǎng)絡的增強，因此需要更高的熔融能量。

UV照射可提高明膠分子間的交聯(lián)導致凝膠強度提高，黏度顯著降低，熔化焓值顯著改變，表明紫外線輻射作為一種改善魚明膠品性的手段具有一定的應用前景。

1.5 糖和鹽對魚明膠品質(zhì)的影響

魚明膠在食品行業(yè)應用廣泛，而食品成分復雜，添加有多種輔料，尤其是糖和鹽。為了解食品中添加糖和鹽是否會影響魚明膠的理化性質(zhì)，SOW等[11]用鈉鹽和蔗糖分別處理羅非魚明膠溶液以研究這兩種添加劑對魚明膠結構及凝膠強度的影響。結果顯示，鈉鹽的加入不利于明膠的凝膠強度，如存儲時間為0 d時對照組和鹽處理組凝膠強度分別為(165±11)g和(137±7)g。究其原因，HAUG等[12]認為Na+的添加會增加溶液的離子強度，這可能會產(chǎn)生短程靜電相互作用的篩選效應導致α-鏈的靜電橋減少；CHOI等[13]認為是Na+破壞明膠結構中的氫鍵并干擾疏水相互作用所致。為進一步探究鹽對魚明膠的影響原因，SOW等[11]通過傅立葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)和原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)研究明膠的二級結構和納米結構，發(fā)現(xiàn)Na+的加入會導致明膠二級結構分子排布的失序，誘導明膠大納米聚集體的形成?？傊?，鹽離子的添加改變了明膠初始成核位點(接合區(qū))的形成和蛋白質(zhì)構象，從而阻止了剛性凝膠的形成[3]。

SOW等[11]在魚明膠溶液中加入蔗糖后，明膠的初始凝膠強度小于對照組，但儲存15 d后的凝膠強度大于對照，其原因可能是加入的蔗糖與明膠競爭水分子發(fā)生水合反應從而延緩凝膠時間。KOLI等[14]發(fā)現(xiàn)非電解質(zhì)，如糖、甘油的加入會穩(wěn)定氫鍵從而會增加凝膠強度，但將質(zhì)量濃度為7.5% 的蔗糖加入到黃花魚明膠中凝膠強度反而由170 g下降到150.5 g。而CHOI等[13]分別將質(zhì)量濃度為2%～14%的蔗糖處理豬明膠和魚明膠時，觀察到凝膠強度的增加。在SOW等[11]的研究中，當將1.5%蔗糖加入到魚明膠中時，沒有發(fā)現(xiàn)凝膠強度的改善。這些現(xiàn)象可能與魚明膠來源和蔗糖濃度的差異有關。后續(xù)的研究中用多糖，如κ-角叉菜膠，進行魚明膠的改性，κ-角叉菜膠中的帶負電的硫酸根基團會與明膠中的帶正電的基團發(fā)生靜電相互作用使明膠大分子的構象變化，且這種相互作用的穩(wěn)定性高于明膠螺旋結構區(qū)中的氫鍵，從而提高明膠的凝膠強度和熱學穩(wěn)定性[15-16]。

針對糖與鹽對魚明膠的不同改性效果，科研工作者用不同濃度的鈣鹽和冷凝膠(gellan,一種胞外多糖)共同對羅非魚明膠進行改性，冷凝膠能與魚明膠形成“異種連接區(qū)”以提高魚明膠的凝膠強度，而以合適濃度加入的Ca2+會與冷凝膠的陰離子域(COO-)直接交聯(lián)，顯著降低明膠聚集體的直徑，加固凝膠網(wǎng)絡，增強凝膠強度[17-18]。

2 輔助傳統(tǒng)提取法提取明膠

由于具有預期活性的明膠肽的制備通常是耗時的過程，而長時間酸或堿或酶處理都會影響明膠的品質(zhì)，因此在短時間內(nèi)如能提供足夠的能量就可能提高明膠水解產(chǎn)物的生產(chǎn)效率及明膠品質(zhì)。出于這種考慮，科學家們采用了多種預處理方法來達到這種目的，主要包括超聲波和高壓輔助法。

2.1 超聲波輔助法提取明膠

YU等[19]基于建立的動力學模型研究了超聲波預處理對膠原酶水解明膠動力學參數(shù)的影響。結果顯示，超聲波處理后，膠原酶催化的反應速率常數(shù)和酶失活常數(shù)分別提高了27.5%和27.8%，水解活化能(活化能指啟動水解反應需要的最小能量[20])和酶滅活能分別降低了36.3%和43.0%。這些數(shù)據(jù)表明超聲波處理后的水解反應更容易發(fā)生，進而有助于提高明膠的產(chǎn)量。

為研究超聲波對鳙魚(Hypophthalmichthysnobilis)魚鱗明膠產(chǎn)量及品質(zhì)的影響，TU等[21]在60 ℃熱萃取魚鱗明膠時用200 W的超聲波分別協(xié)助處理1、3和5 h，結果發(fā)現(xiàn)超聲波處理時間越長，明膠產(chǎn)量越高，超聲波處理組產(chǎn)量為30.94%～46.67%，比對照組提高了28.25%～61.56%。究其原因是在提取過程中超聲波的機械和空化效應會使水分能更多地滲透到魚鱗基質(zhì)中，并提供了更多的攪動來破壞魚鱗；增長處理時間則直接提供了更多的能量來破壞穩(wěn)定膠原結構的鍵以及α-鏈的肽鍵，加劇螺旋向線圈的轉(zhuǎn)變，導致更多的膠原轉(zhuǎn)化成可溶性明膠。

為探索超聲波影響明膠品質(zhì)的作用機理，YU等[19]采用了AFM、熒光光譜和FITR研究超聲處理對明膠結構的影響。通過AFM檢測明膠發(fā)現(xiàn)，用聲波處理的明膠其膠粒的平均直徑、平均高度和體積都明顯下降，其原因可能是超聲波的物理效應使蛋白質(zhì)分子之間的靜電和疏水相互作用破壞，從而使蛋白質(zhì)顆粒的直徑變小；亦可能是超聲波在液體介質(zhì)中傳播時會產(chǎn)生氣穴現(xiàn)象，使液體中的低壓氣泡突然形成并破裂，這種破裂會產(chǎn)生強的剪切力，有助于超聲波的物理作用。熒光光譜發(fā)現(xiàn)超聲波處理會使明膠結構中疏水殘基的微環(huán)境發(fā)生變化，從而影響明膠的溶解度。FITR觀察到因超聲波作用而發(fā)生顯著降低的酰胺I、II帶進行去卷積和峰擬合，明膠α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲結構的變化率分別為-28.04%、-2.74%、-32.29%和-15.38%。以上結果說明超聲波處理會改變明膠的二級結構，這正是超聲波改變明膠品質(zhì)的原因。

2.2 高壓輔助法提取明膠

高壓技術是在一定的溫度下將食品等材料于100～1 000 MPa壓力下處理一段時間，達到殺菌、殺酶及改善食品功能性質(zhì)的一種加工技術[22]，其通過改變蛋白質(zhì)的三、四級結構從而改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。ZHANG等[22]用100～500 MPa壓力處理巴沙魚皮樣品時，明膠提取率增長幅度為 10.62%～ 15.62%；在提高產(chǎn)量的同時，高壓處理也提高了魚明膠的凝膠強度，當壓力為300 MPa，處理時間為10 min得到的巴沙魚皮明膠凝膠強度最好，為282 g，顯著高于對照組的200 g，這歸功于高壓引起了蛋白質(zhì)聚集效應。GMEZ-GUILLéN等[23]在熱水解提取鰨魚皮明膠時適當延長施壓時間(由10 min延長到20 min)或加大壓力(由250 MPa升高至400 MPa)，所得明膠分子質(zhì)量分布情況將得到一定的改善，會得到較多高分子質(zhì)量聚合物肽，其α-、β-鏈，特別是γ-鏈含量將得到顯著提升，這表明一定程度的壓力和處理時間有誘導蛋白聚集作用。高分子質(zhì)量的肽含量越高，魚明膠的凝膠/融膠溫度越高，相應地凝膠能力越強。高壓誘導蛋白質(zhì)聚集作用在不同來源的明膠提取中亦有報道[24-26]。

高壓輔助法提取魚明膠，會使穩(wěn)定膠原蛋白的非共價鍵紊亂從而提高明膠的產(chǎn)量。適合的壓力及時間會對明膠的結構產(chǎn)生影響，誘導蛋白質(zhì)聚集提高明膠中高分子質(zhì)量肽的含量，從而提高明膠的品質(zhì)。

3 酶對魚明膠改性研究

以上內(nèi)容討論的是對傳統(tǒng)酸堿提取明膠方法的優(yōu)化，與傳統(tǒng)的酸堿提取法相比，科研工作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶水解法具有處理時間短，廢物產(chǎn)生少等優(yōu)點，如在特定的酶與底物比例和溫度條件下使用胃蛋白酶對天然皮膚中膠原蛋白的消化作用可高達80%～90%(取決于來源)[27]。酶的合理利用已成為提取明膠的新方法。

用于魚明膠改性的酶可大致分為兩類：外源性蛋白酶和內(nèi)源性蛋白酶。有報道用外源酶酪氨酸蛋白酶對魚明膠的改性以提高魚明膠的功能性質(zhì)，但由于價格昂貴以致使用受限[28]。在不斷的探索后發(fā)現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTGase)是一種更好的選擇，這是一種從鏈球菌屬獲得的Ca2 +非依賴性酶，通過催化賴氨酸殘基的ε-氨基與谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基團之間的交聯(lián)肽鍵的形成，誘導蛋白質(zhì)N-ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸交聯(lián)的形成[29]，故而成為提高魚明膠品質(zhì)的一種新酶。

除了通過外源酶降解明膠鏈外，存在于皮膚中的內(nèi)源性蛋白酶在高溫提取明膠時會使明膠長鏈降解為短鏈。內(nèi)源蛋白酶主要包括內(nèi)臟中的消化性蛋白酶和魚皮膚中的膠原蛋白酶。膠原蛋白酶主要降解細胞外基質(zhì)的蛋白結構，特別是I型和II型膠原的三螺旋鏈的Gly775-Leu(Ile)776位點。膠原蛋白經(jīng)過膠原酶的初步特異性切割之后，會形成3/4-和1/4-的裂解產(chǎn)物并且使膠原蛋白自發(fā)變性(螺旋到線圈轉(zhuǎn)變)成為明膠[30]。膠原酶又被分為兩大類：金屬性膠原酶和絲氨酸膠原酶。魚皮中通常存在著絲氨酸膠原酶，這是一種熱激活性的蛋白酶[31]，能水解魚皮基質(zhì)，故而可能影響魚皮明膠的提取及所得明膠的性質(zhì)。以下分別闡述外源性蛋白酶及內(nèi)源性蛋白酶及其酶抑制對魚明膠改性的影響研究。

3.1 外源性蛋白酶對魚明膠改性的研究

WANGTUEAI等[29]在狗母魚(Sauridaspp.)魚鱗中提取明膠時探索了MTGase對魚鱗明膠的品性影響。將不同質(zhì)量濃度的MTGase(0.1%～0.6%)添加到明膠溶液中，發(fā)現(xiàn)隨著添加濃度的升高，所得魚明膠的凝膠強度隨之提高。該酶可有效地提高魚明膠的熱學穩(wěn)定性(膠融溫度)、機械強度(凝膠強度)及流變學特性，獲得的明膠產(chǎn)品可達到哺乳動物來源明膠的物理特性，新工藝對魚鱗明膠的產(chǎn)業(yè)化應用提供了新的指導思路，具有巨大的工業(yè)化生產(chǎn)價值；但MTGase催化法是通過MTGase酶使明膠中賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-羥酰胺基發(fā)生共價交聯(lián)，形成不可逆共價化合物，從而達到提高魚鱗明膠物理特性的目的。由于高濃度的MTGase使魚明膠中氨基酸發(fā)生了不可逆交聯(lián)，導致其在體內(nèi)的可吸收性下降，降低了魚明膠的營養(yǎng)價值及其在食品工業(yè)中的應用范圍。

針對以上問題，科研工作者研究發(fā)現(xiàn)低濃度的MTGase與其他物質(zhì)，如果膠，混合添加能產(chǎn)生協(xié)同效應，能更有效地改善魚明膠低熔點低強度的缺陷的同時又對明膠的工業(yè)價值基本無影響。HUANG等[32]分別將不同質(zhì)量濃度的MTGase(0.02%、 0.04%、0.06%) 和果膠(1%、 3%、5%)加入到鳙魚(Hypophthalmichthysnobilis) 魚鱗明膠溶液中研究兩種物質(zhì)對魚明膠品性的影響。發(fā)現(xiàn)用這2種添加物分別處理過后的魚明膠融膠溫度均有提高，且果膠改性效果更好，但MTGase對形成良好的凝膠網(wǎng)絡更為有利。綜合二者特性， HUANG等[33]做了進一步的研究，將二者混合添加，結果發(fā)現(xiàn)MTGase和果膠的質(zhì)量濃度分別為0.06%和0.8%時，改性明膠具有最佳凝膠強度(523.89 g)、凝點/融點和粘性，且這種作用效果比MTGase或果膠單獨作用更為顯著。究其原因是適當濃度的果膠會通過靜電相互作用和明膠形成果膠-明膠復合物，這種復合物會改變蛋白質(zhì)的聚集；MTGase則會催化果膠-明膠復合物之間的共價交聯(lián)以強化凝膠網(wǎng)絡，而這種共價鍵會影響三螺旋形成，有利于明膠的熱穩(wěn)定性；且明膠的質(zhì)地分析顯示高凝膠強度的明膠擁有更好的剛性、內(nèi)聚力和咀嚼性。以上結果表明，低濃度的MTGase與低濃度的果膠能協(xié)同改性魚明膠，在節(jié)約成本的同時能使其更好地應用于市場，這為魚明膠的改性創(chuàng)立了新途徑。

3.2 內(nèi)源性蛋白酶和酶抑制劑

在魚皮膚中的內(nèi)源性蛋白酶也是可加以利用獲得所需的魚明膠品性。在提取魚明膠時，熱穩(wěn)定的內(nèi)源性蛋白酶可通過破壞膠原分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)作用導致膠原蛋白的不穩(wěn)定而分解為明膠；但提取溫度的升高及時間的延長會造成高分子質(zhì)量蛋白水解過度，使明膠的品性下降。因此，合理使用蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白酶的活性是獲得高品質(zhì)明膠的有效手段。

NALINANON等[34]使用內(nèi)源性蛋白酶輔助堿法提取大眼鯛(Priacanthustayenus)魚皮明膠，觀察到內(nèi)源性蛋白酶存在時提取效率提高，但明膠的β-，α1-和α2-鏈大量降解；當加入抑制熱激活絲氨酸蛋白酶的大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)抑制蛋白酶的進一步作用時，這種降解現(xiàn)象顯著減少，魚明膠品性顯著增強。同樣，AHMAD等[35]在提取魚明膠時添加0.04 mmol/L的SBT1后發(fā)現(xiàn)因SBT1抑制了內(nèi)源性的絲氨酸蛋白酶對膠原蛋白的自水解作用，明膠的產(chǎn)量雖有所下降，但保持了皮膚基質(zhì)中的高分子質(zhì)量肽的含量，使其無法實現(xiàn)三螺旋向無規(guī)線圈結構的轉(zhuǎn)化，從而可以獲得高品性的魚明膠產(chǎn)品。雖然SBT1的加入會在一定程度上抑制膠原蛋白的水解而降低提取率，但SBT1的加入使利用內(nèi)源性酶改性的魚明膠具有更多高分子質(zhì)量肽、更多的三螺旋結構及更為緊密的網(wǎng)絡結構，更好的凝膠強度及更穩(wěn)定的乳化性能[36]。

4 結論與展望

魚明膠的品質(zhì)受多因素的影響，首先，魚類的生活環(huán)境不同，其魚基質(zhì)中氨基酸的分布、膠原蛋白的結構都會有所差異；其次，魚類在儲運過程中的保存方式也會影響其品質(zhì)；魚明膠的提取存在著原材料膠原蛋白的水解變性及復性為明膠的過程，提取溫度高、時間長、酸堿試劑濃度過高都會使魚膠原過分溶解，使其難以復性，導致魚明膠的品質(zhì)差；而提取溫度低、時間短、酸堿試劑濃度低則會降低魚明膠的產(chǎn)量。為克服該缺點，科研工作者在魚明膠的提取方法上進行了革新，如用物理因素(高壓、超聲波)輔助酸堿法提取明膠；研究了外源性蛋白酶及內(nèi)源性蛋白酶對明膠改性的影響等。本文所闡述的方法在一定程度上提高了魚明膠的品質(zhì)，甚至達到哺乳動物明膠的水平；但品質(zhì)與產(chǎn)量往往不能同時提升，說明魚明膠的提取方法還需要進一步深入的研究及探討。未來的研究必須是如何在低成本、低污染的條件下實現(xiàn)高產(chǎn)并獲得高品質(zhì)魚明膠。本實驗室正嘗試一種新的方法，使用分子生物學和蛋白質(zhì)學結合法使魚明膠中的脯氨酸轉(zhuǎn)化為羥基脯氨酸以提高其品質(zhì)的研究，以克服魚明膠的缺陷，使其達到哺乳動物來源的明膠特點，使魚明膠的應用走向食品醫(yī)藥工業(yè)等更寬廣的領域。