潘小紅，劉玉玲，周利平

（1.湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院，湖南長(zhǎng)沙　410001；2.湖南省科技交流交易中心，湖南長(zhǎng)沙　410001）

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提取凈化方法對(duì)蔬菜中多菌靈殘留測(cè)定影響的研究

潘小紅1，劉玉玲1，*周利平2

（1.湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院，湖南長(zhǎng)沙410001；2.湖南省科技交流交易中心，湖南長(zhǎng)沙410001）

摘要：采用高效液相色譜法測(cè)定多菌靈殘留量，研究了液液萃取、固相萃?。ㄊ謩?dòng)）、固相萃取（自動(dòng)）及快速溶劑-固相萃取4種不同提取凈化方法在不同類(lèi)別蔬菜中對(duì)多菌靈殘留量測(cè)定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，液液萃取的提取效果最低。新鮮蔬菜中，固相萃?。ㄊ謩?dòng)）、固相萃?。ㄗ詣?dòng)）及快速溶劑-固相萃取效果基本一致；干制蔬菜中，固相萃取的提取效果約為快速溶劑-固相萃取的90%～95%，2種方法準(zhǔn)確性及檢出濃度均能滿(mǎn)足GB/T 23380—2009的要求。結(jié)果表明，固相萃?。ㄊ謩?dòng)）適用于新鮮蔬菜中多菌靈殘留量的測(cè)定，干制蔬菜推薦用快速溶劑-固相萃取。該研究簡(jiǎn)化了新鮮蔬菜提取凈化步驟，降低多菌靈殘留測(cè)定成本，提高了檢測(cè)效率。

關(guān)鍵詞：多菌靈殘留；蔬菜；固相萃??；快速溶劑萃取

多菌靈（Carbendazim）是一種常用的內(nèi)吸性廣譜殺菌劑，廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物防治工作中，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)人、畜均有一定毒性，因此有關(guān)多菌靈殘留量的分析已經(jīng)越來(lái)越受到重視[1-2]。

目前，國(guó)家及地方標(biāo)準(zhǔn)多菌靈殘留測(cè)定中樣品前處理的萃取及凈化方法各不相同，《GB/T 20769—2008水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》采用Sep- Pak Vac柱及無(wú)水硫酸鈉[3]、《GB/T 23380—2009水果、蔬菜中多菌靈殘留的測(cè)定高效液相色譜法》的快速溶劑萃取-固相萃取[4]、《NY/T 1453—2007蔬菜及水果中多菌靈等16種農(nóng)藥殘留測(cè)定液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》的固相萃取[5]、《GB/T 5009.188—2003蔬菜、水果中甲基托布津、多菌靈的測(cè)定》的液液萃取法[6]。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，各種方法對(duì)不同類(lèi)別蔬菜中多菌靈殘留量的測(cè)定不完全適用，本研究采用高相液相色譜法檢測(cè)多菌靈殘留量，對(duì)比了液液萃取、固相萃?。ㄊ謩?dòng)）、固相萃?。ㄗ詣?dòng)）及快速溶劑-固相萃取在不同類(lèi)別蔬菜中對(duì)多菌靈殘留量測(cè)定的影響，提高前處理的專(zhuān)屬性。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)原料

干品蔬菜（食用菌香菇、干辣椒）、新鮮蔬菜（蘿卜、生菜、西紅柿）均為超市購(gòu)買(mǎi)，陽(yáng)性樣品（四季豆、香菇）為2015年國(guó)家餐飲風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)樣品。

1.1.2儀器與試劑

Ultimate 3000型高效液相色譜儀、DIONEX ASE 350型快速溶劑萃取儀，戴安公司產(chǎn)品；GX- 274型ASPEC全自動(dòng)固相萃取儀，吉爾森公司產(chǎn)品；TB-215D型電子分析天平，DENVER公司產(chǎn)品。

乙腈、乙酸乙酯、甲醇為色譜純，其余均為分析純；多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)為90330，含量為99.5%，德國(guó)Dr.Ehrensorfer產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件的選擇

色譜柱，Thermo120°A（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相，流動(dòng)相V（0.02 mol/L，pH值6.8磷酸鹽緩沖液）+ V（乙腈）= 80+20；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)取多菌靈26.6 mg至100 mL容量瓶中，加甲醇溶至刻度，搖勻，用甲醇稀釋0.053 2～26.6 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3提取條件的選擇

（1）液液萃取法。準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎并混合均勻的樣品（新鮮蔬菜25 g，干制蔬菜5 g）于50 mL離心管中，加入甲醇-冰醋酸樣品液（配比為9∶1），振搖30 min，用石油醚振搖2次，每次25 mL，棄去石油醚，45℃水浴中減壓濃縮近干，用5 mL流動(dòng)相溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，供液相色譜測(cè)定。

（2）固相萃?。⊿PE）法。分為全自動(dòng)固相萃取及手動(dòng)固相萃取。

準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎并混合均勻的樣品（新鮮蔬菜25 g，干制蔬菜5 g）于50 mL離心管中，加入50 mL甲醇-冰醋酸樣品液（配比為9∶1），振搖30 min，取固相萃取小柱（OasisR MCX，150 mg/6 mL）依次用5 mL甲醇、5 mL超純水進(jìn)行活化。移取10 mL甲醇-冰醋酸樣品，全部通過(guò)固相萃取小柱，棄去流出物。先后用5 mL超純水、5 mL甲醇淋洗，抽干小柱，棄去流出物。再用5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，收集，氮吹儀上濃縮至干，用1 mL流動(dòng)相溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

（3）快速溶劑-固相萃?。ˋSE）法。準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎并混合均勻的樣品（新鮮蔬菜10 g，干制蔬菜5 g），加入適量硅藻土拌勻，上快速溶劑萃取儀，使用34 mL萃取池，溫度100℃，壓強(qiáng)13.80 MPa，加熱5 min，以甲醇為溶劑靜態(tài)萃取5 min，60%溶劑快速?zèng)_洗樣品，60 s氮?dú)獯祾?，循環(huán)1次，收集全部提取液。45℃水浴中減壓濃縮近干，加10 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液溶解，將上述溶液全部轉(zhuǎn)移至活化后的固相萃取小柱，活化及萃取過(guò)程參照（2）固相萃取法。

1.2.4樣品測(cè)定

采用1.2.2固相萃取法和快速溶劑-固相萃取法。

2　結(jié)果與分析

2.1回收率分析

從多菌靈的化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，是一種兩性化合物。在中性和偏堿性水溶液中溶解度低，微溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有機(jī)溶劑，能溶于無(wú)機(jī)酸和乙酸等。有機(jī)酸、堿性條件可增加多菌靈在有機(jī)溶劑中的溶解度，因此本試驗(yàn)固相萃取、液液萃取均采用甲醇冰醋酸為提取劑[7]。

分別在稱(chēng)好的5 g干品蔬菜（食用菌、干辣椒）、25 g新鮮蔬菜（蘿卜、生菜、西紅柿）添加3.2，14.0，21.2 μg多菌靈進(jìn)行低、中、高回收率試驗(yàn)。

不同提取方式各種蔬菜的回收率見(jiàn)表1。

表1　不同提取方式各種蔬菜的回收率/ %

從表1可以看出，液液萃取的回收率介于78.3%～91.8%，固相萃取的回收率介于86.4%～100.2%，快速溶劑-固相萃取回收率介于85.4%～101.4%，固相萃取、快速溶劑-固相萃取回收率低、中、高3個(gè)濃度均高于液液萃取，固相萃?。ㄊ謩?dòng)）、固相萃?。ㄈ詣?dòng)）、快速溶劑-固相萃取之間回收率無(wú)明顯差異。

2.2陽(yáng)性樣品測(cè)定[8]

選用2015年國(guó)家餐飲風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的2批陽(yáng)性樣品（香菇、四季豆）進(jìn)行殘留量的測(cè)定。

陽(yáng)性樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　陽(yáng)性樣品測(cè)定結(jié)果/ mg·kg-1

從表2中可以看出，新鮮蔬菜（四季豆）陽(yáng)性樣品測(cè)定中，快速溶劑-固相萃取與固相萃取的結(jié)果均大于液液萃取，固相萃取自動(dòng)與手動(dòng)結(jié)果一致、快速溶劑-固相萃取與固相萃取的結(jié)果變化不大；干制蔬菜（香菇）陽(yáng)性樣品測(cè)定中，快速溶劑-固相萃取＞固相萃?。疽阂狠腿?。

表1與表2的數(shù)據(jù)顯示，樣品加標(biāo)回收率及陽(yáng)性樣品的測(cè)定，液液萃取效果均明顯低于固相萃取與快速溶劑-固相萃??；加標(biāo)回收率及新鮮蔬菜的陽(yáng)性樣品（四季豆）固相萃取與快速溶劑-固相萃取的測(cè)定結(jié)果基本一致，干制蔬菜陽(yáng)性樣品（香菇）中固相萃取測(cè)定結(jié)果低于快速溶劑-固相萃取。推測(cè)原因有3個(gè)：一是液液萃取是利用多菌靈在酸性甲醇及二氯甲烷中的不同溶解度進(jìn)行分離，存在提取不夠完全，回收率較低；二是加標(biāo)回收是用多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液直接添加至樣品溶液中，陽(yáng)性樣品中的多菌靈殘留在植物細(xì)胞內(nèi)，因此陽(yáng)性樣品液液萃取的測(cè)定結(jié)果比其他3種提取方式的結(jié)果低；三是干制蔬菜相對(duì)新鮮蔬菜，其植物組織不易破壞，快速萃取儀有利于多菌靈殘留的提取，增加了測(cè)定結(jié)果。

本研究選擇新鮮蔬菜用固相萃?。ㄊ謩?dòng)）、干制蔬菜用快速溶劑-固相萃取測(cè)定多菌靈殘留。

2.3樣品測(cè)定及方法學(xué)考察

2.3.1線性方程考察

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1　多菌靈標(biāo)準(zhǔn)色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果表明，該方法在0.053 2～26.6 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其回歸方程為Y=0.373 5X+0.461 7，R2=0.999 3。

2.3.2重現(xiàn)性考察

分別取新鮮蔬菜（四季豆）及干制蔬菜（香菇）各6份，采用固相萃取（手動(dòng)）及快速溶劑-固相萃取測(cè)定。

固相萃?。ㄊ謩?dòng)）及快速溶劑-固相萃取方法重現(xiàn)性試驗(yàn)見(jiàn)表3。

表3　固相萃?。ㄊ謩?dòng)）及快速溶劑-固相萃取方法重現(xiàn)性試驗(yàn)

從表3中可以看出，采用固相萃?。ㄊ謩?dòng)）前處理的新鮮蔬菜（四季豆）及快速溶劑-固相萃取的干制蔬菜（香菇）重現(xiàn)性均較好，RSD分別為2.8%和2.5%。

多菌靈及四季豆陽(yáng)性樣品色譜見(jiàn)圖2。

圖2　多菌靈及四季豆陽(yáng)性樣品色譜

2.3.3檢出限及定量限

本方法的檢出限為0.105 ng，定量下限為0.309 ng。取5 g樣品測(cè)定時(shí)，檢出濃度為0.004 2 mg/kg，最低定量濃度為0.006 1 mg/kg，能夠滿(mǎn)足《GB/T 23380—2009水果、蔬菜中多菌靈殘留的測(cè)定高效液相色譜法》0.02 mg/kg的要求。

3　結(jié)論與討論

本研究對(duì)比了液液萃取、固相萃?。ㄊ謩?dòng)）、固相萃?。ㄗ詣?dòng)）及快速溶劑-固相萃取4種不同前處理方式在不同類(lèi)別蔬菜中對(duì)多菌靈殘留量測(cè)定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)液液萃取效果最低，固相萃?。ㄊ謩?dòng)）與固相萃?。ㄗ詣?dòng)）效果相同；新鮮蔬菜中，固相萃取與快速溶劑-固相均可；干制蔬菜中，固相萃取的提取效果約為快速溶劑-固相萃取的90%～95%。固相萃?。ㄊ謩?dòng)）、快速溶劑-固相萃取均具有良好的重現(xiàn)性，能夠滿(mǎn)足《GB/T 23380—2009水果、蔬菜中多菌靈殘留的測(cè)定高效液相色譜法》的要求。

快速溶劑-固相萃取對(duì)輔助儀器的要求比較多，加速溶劑萃取儀（ASE）、固相萃取儀（SPE）購(gòu)買(mǎi)及維護(hù)成本較高，在不少農(nóng)藥殘留檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中都沒(méi)有配備，建議新鮮蔬菜中多菌靈殘留量的測(cè)定采取固相萃取（手動(dòng)）前處理方式，所用儀器、化學(xué)試劑都可獲得，且成本低，可以準(zhǔn)確測(cè)定新鮮蔬菜中多菌靈的殘留量。

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Study on the Effect of Extraction and Purification Method on the Determination of Carbendazim Residue in Vegetables

PAN Xiaohong1，LIU Yuling2，*ZHOU Liping2
（1. Hu'nan Provincial Food and Dung Inspction and Research Institute，Changsha，Hu'nan 410001，China；2. Hu'nan Science and Technology Exchange Center，Changsha，Hu'nan 410001，China）

Abstract：With high performance liquid phase chromatography determination of carbendazim residue，effects of four different extraction and purification methods of liquid- liquid extraction，SPE（manual），SPE（automatic）and FSE- SPE extraction are studied. Found that liquid- liquid extraction has lowest effect，SPE（manual & automatic），and FSE- SPE had the same effect in fresh vegetables，SPE（manual & automatic）is about 95%～90% of FSE in dry vegetables，and accuracy of these two methods are can meet the requirements of GB/T 23380—2009. The results show that SPE（manual）is applicable for the determination of carbendazim residues in fresh vegetables and FSE- SPE extraction is recommended to dry vegetables. This study simplifies the extract purification step，cut cost and improve the detection efficiency on the determination of carbendazim residue in fresh vegetables.

Key words：carbendazim residue；vegetables；solid phase extraction（SPE）；fast solvent extraction（FSE）

作者簡(jiǎn)介：潘小紅（1983—），女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)槭称放c保健食品及化妝品的檢驗(yàn)和研發(fā)。*通訊作者：周利平（1965—），女，博士，副研究員，研究方向?yàn)榭萍汲晒茝V、產(chǎn)業(yè)技術(shù)轉(zhuǎn)移和科技金融。

收稿日期：2016- 01- 22

文章編號(hào)：1671- 9646（2016）03b- 0054- 04

中圖分類(lèi)號(hào)：TS255.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.042