李增林，吳丹丹，李洪雨，陳 剛，劉小娟，甯順腙，劉登才，張連全

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川成都 611130)

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小麥屬物種ω-醇溶蛋白序列的克隆與分析

李增林，吳丹丹，李洪雨，陳 剛，劉小娟，甯順腙，劉登才，張連全

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川成都 611130)

摘要：為了挖掘ω-醇溶蛋白在小麥品質(zhì)育種中的潛力，利用2對引物采用基因組PCR方法分別從阿拉拉特小麥(Triticum timopheevi Zhuk. var. araraticum)、栽培二粒小麥 (Triticum turgidum ssp. dicoccon)、提莫菲維小麥(Triticum timopheevi)、 栽培一粒小麥(Triticum monococcum ssp. monococcum)和野生一粒小麥(Triticum monococcum var. boeoticum)5個(gè)小麥屬物種中克隆出ω-醇溶蛋白序列，并對其進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，本研究共克隆到6條新的ω-醇溶蛋白序列，歸屬于ARH、ATN和TRQ三種類型。這些新的ω-醇溶蛋白序列的長度為927～1 095 bp。在這6個(gè)序列中，除KR082150擁有兩個(gè)甲硫氨酸(Met)外，其余的均缺少含硫氨基酸。進(jìn)化分析表明，本研究獲得的6條ω-醇溶蛋白序列聚在了2個(gè)主要的分支，其中N端第一個(gè)氨基酸為丙氨酸(Ala)的ω-醇溶蛋白聚在了一個(gè)大的分支中，而TRQ類型的則聚在了另一個(gè)分支中。

關(guān)鍵詞：小麥屬物種；ω-醇溶蛋白；基因克??；系統(tǒng)進(jìn)化

小麥胚乳貯藏蛋白主要由麥谷蛋白和麥醇溶蛋白組成，其中，麥醇溶蛋白約占小麥胚乳貯藏蛋白總量的50%～60%[1-3]，主要決定面團(tuán)的粘性和延展性[4-6]。根據(jù)醇溶蛋白在酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率和分子結(jié)構(gòu)的不同，可分為α-/β-、γ-和ω-三大類[5,7-8]。根據(jù)成熟蛋白N端的前三個(gè)氨基酸可將ω-醇溶蛋白分為ARQ/E、KEL、SRL和TRQ等類型[9-11]。但ω-醇溶蛋白的基本結(jié)構(gòu)比較保守，包括含19個(gè)氨基酸殘基的信號肽區(qū)域、含12個(gè)氨基酸殘基的N-末端、含90%～96%的氨基酸的中央重復(fù)區(qū)、含9～12個(gè)氨基酸殘基的C-末端4個(gè)區(qū)域[9,11]。ω-醇溶蛋白的主要特征是含有大量的谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)殘基(總共占到氨基酸殘基數(shù)的80%)，但是明顯缺乏含硫氨基酸，即半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)[12-13]。研究表明，醇溶蛋白不僅與小麥的加工品質(zhì)密切相關(guān)，也是遺傳性疾病-乳糜瀉(Celiac diease,CD)的主要外在刺激蛋白[14-18]。其中，在ω-醇溶蛋白中發(fā)現(xiàn)3種(Gli-ωt: PQQPFPQQ; Gli-1: PFPQPQQPF; Gli-2: PQPQQPFPW)可誘發(fā)CD發(fā)生的T-細(xì)胞免疫肽段[16-18]。盡管了解和運(yùn)用ω-醇溶蛋白具有非常重要的意義，但目前通過PCR克隆得到的ω-醇溶蛋白數(shù)量仍然非常有限[9-10,19-22]。鑒于此，本研究擬以小麥屬物種阿拉拉特小麥(TriticumtimopheeviZhuk. var.araraticum,AAGG,2n=4x=28)、栽培二粒小麥(Triticumturgidumssp.dicoccon,AABB,2n=4x=28)、提莫菲維小麥(Triticumtimopheevi,AAGG,2n=4x=28)、栽培一粒小麥(Triticummonococcumssp.monococcum,AA,2n=2x=14)和野生一粒小麥(Triticummonococcumvar.boeoticum,AA,2n=2x=14)為材料，采用基因組PCR法進(jìn)行ω-醇溶蛋白序列克隆，并對其進(jìn)行序列分析，以期豐富ω-醇溶蛋白的遺傳信息，為ω-醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究提供參考。

1材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共計(jì)5份，包括阿拉拉特小麥(PI352265)、栽培二粒小麥(PI352365)、提莫菲維小麥(PI221421)、栽培一粒小麥(PI352479)和野生一粒小麥(G52)，除G52由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所提供外，其他均由美國種質(zhì)資源信息庫(NPGS)惠贈。

1.2 ω-醇溶蛋白序列的克隆

用DNA提取試劑盒 Plant Genomic DNA Kit (TIANGEN公司)提取室內(nèi)培養(yǎng)一周左右的植株葉片DNA。引物F1/R1(F1:5′-TCAAGG TGTGTAGTGTAAAG-3′; R1:5′-ATTTGTCC TGGTTGCTAGGAA-3′)和F2/R2(F2:5′-GC TAGGG/CAA/GT/CTAAACCCTAA/GC-3′; R2: 5′ - TCATTGGCCACCGATGCT/CTG/ATT-3′)分別依據(jù)李 敏等[23]和莊倩倩等[22]文獻(xiàn)報(bào)道的序列所設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增體系：模板DNA 100 ng，10×LA PCR buffer 5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1) 5 μL,上下游引物各(20 μmol·L-1)1.5 μL，2.5 U的高保真LATaq酶(TaKaRa公司)0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后選擇合適的片段進(jìn)行回收，并與pMD19-T載體 (TaKaRa公司)連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10感受態(tài)細(xì)胞中，然后通過菌液PCR鑒定陽性克隆。最后隨機(jī)挑取5個(gè)陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.3序列分析

用DNAMAN軟件(Version 6.0.3,Lynnon Biosoft,Canada)將核苷酸序列翻譯為氨基酸序列。用Clustal X 2.0軟件對核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行比對。用NCBI提供的在線BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 工具對核苷酸及氨基酸序列的同源序列進(jìn)行搜索。用Mega 6.0軟件(鄰接法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1小麥屬物種中ω-醇溶蛋白序列的克隆

利用引物F1/R1和F2/R2對5個(gè)小麥屬物種的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到6條大小約1 000 bp的目的條帶(圖1)。將目的條帶回收純化后連接到pMD19-T載體，通過菌液PCR鑒定出陽性克隆后進(jìn)行了測序。測序獲得6個(gè)不同的序列(F1/R1的PCR產(chǎn)物5個(gè)，F(xiàn)2/R2的PCR產(chǎn)物1個(gè))。NCBI在線BLAST表明，6個(gè)新序列與已知的ω-醇溶蛋白基因序列相似度大于86%。將這6個(gè)新序列提交至Genbank，得到序列登錄號為KR082149～KR082154。通過ORF Finder分析發(fā)現(xiàn)，這6個(gè)新序列均不含有內(nèi)含子，但是都存在至少4個(gè)終止密碼子，推測這些序列全部為假基因。

M：DL1000；1～5：引物組合F1/R1的PCR產(chǎn)物，依次來源于PI352265、PI352365、PI221421、G52和PI352479；6：引物組合F2/R2的PCR產(chǎn)物，來源于PI352265

M: DL1000; 1-5: PCR products amplified with the primer pair F1/R1,which are respectively from PI352265,PI352365,PI221421,G52 and PI352479; 6: PCR product amplified with the primer pair F2/R2,which is from PI352265

圖1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析

Fig.1PCR amplification products

separated by 1.5% agarose gel

2.2氨基酸序列分析

將本研究推導(dǎo)得到的6個(gè)氨基酸序列進(jìn)行了比對分析，發(fā)現(xiàn)其與已發(fā)表的ω-醇溶蛋白擁有相同的保守結(jié)構(gòu)，即含有由19個(gè)氨基酸組成的信號肽、由12個(gè)氨基酸組成的N端區(qū)、由90%～96%的氨基酸組成的中央重復(fù)區(qū)和由9～11個(gè)氨基酸組成的C端區(qū)(圖2)。 氨基酸序列的前三個(gè)氨基酸決定ω-醇溶蛋白的類型[9-10]，本研究推導(dǎo)得到的6個(gè)ω-醇溶蛋白序列包含ARH、ATN和TRQ三種類型(圖2)。與之前的報(bào)道[12-13]一致，本研究獲得的序列在中央重復(fù)區(qū)富含谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)和脯氨酸(Pro)，但是明顯缺乏含硫氨基酸，即缺乏半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)，本研究所得6個(gè)新序列中僅KR082150含有兩個(gè)甲硫氨酸。

盡管ω-醇溶蛋白序列比較保守，我們對克隆獲得的6條和已發(fā)表的3條ω-醇溶蛋白序列相互比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ω-醇溶蛋白序列的N端和C端之間均有部分差異。首先N端的前三個(gè)氨基酸變異較普遍，其大多是由堿基突變造成的，如編碼第一個(gè)氨基酸處的核苷酸G突變成A就會導(dǎo)致氨基酸丙氨酸(Ala)被蘇氨酸(Thr)取代(圖2)。而N端后半部分的序列相對比較保守，只有KR082150和JN092580兩條序列與其他相比差異較大，而這兩條序列恰好都是TRQ類型的ω-醇溶蛋白(圖2)。相比N端，ω-醇溶蛋白C端差異更大，不同的序列有自己專屬的C端，本研究所克隆的KR082150的C端類型在之前尚未見報(bào)道。此外，ω-醇溶蛋白C端的氨基酸數(shù)目也不盡相同，圖2展示了四種，C端的氨基酸數(shù)目分別為9、10、11和12，而我們克隆獲得的ω-醇溶蛋白序列有三種，C端的氨基酸數(shù)目分別為9、10和11。

2.3系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了研究ω-醇溶蛋白序列的進(jìn)化關(guān)系，將本研究獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫目前已知的其中6個(gè)典型的ω-醇溶蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，這些ω-醇溶蛋白序列分成了2個(gè)主要的分支。N端第一個(gè)氨基酸為丙氨酸(Ala)的ω-醇溶蛋白聚在了一個(gè)大的分支中，包括ARH、ATN、ARE和ARQ四種類型，其中ATN類型的位于ARH類型之間，并且ARE類型的AF280605較ARQ類型的FJ561452距ARH類型更遠(yuǎn)。另一個(gè)分支包括TRQ和SRL兩種類型，其中TRQ類型的KR082150和JN092581聚在了一個(gè)亞分支下，較SRL類的AB181301更近。由此可知，ω-醇溶蛋白的類型可能與進(jìn)化相關(guān)，ω-醇溶蛋白以丙氨酸(Ala)開頭的可能來源相同，TRQ類型的較其他更為保守。

實(shí)線框表示序列存在較大差異；“---”表示本文不做分析的中央重復(fù)區(qū)序列；“·”表示此處沒有堿基

The variation in sequence marked with solid box；“---” represented the repetive domain sequence and not analyzed in this study;“·” represented no base here

圖2ω-醇溶蛋白的多序列比對

Fig.2Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of ω-gliadins

圖3　ω-醇溶蛋白的進(jìn)化分析

3討 論

醇溶蛋白作為小麥籽粒貯藏蛋白中最豐富的組分之一，與麥谷蛋白一起對小麥的加工品質(zhì)有重要影響[13]。目前，除了Hsia和Anderson[16]采用篩選λ基因組文庫法得到了少量ω-醇溶蛋白序列外，利用PCR技術(shù)獲得的ω-醇溶蛋白序列非常少[9-10,19-24]。因此對于新的更多的ω-醇溶蛋白序列的鑒定顯得尤為重要。在本研究中，我們從5個(gè)小麥屬物種中克隆出了ARH、ATN 和TRQ三種類型的6條新的ω-醇溶蛋白序列。由于其編碼區(qū)內(nèi)均沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子，并且都存在至少4個(gè)終止密碼子，所以這6條ω-醇溶蛋白序列被推斷為假基因。分析其終止密碼子的數(shù)目可以發(fā)現(xiàn)，二倍體的栽培一粒小麥和野生一粒小麥ω-醇溶蛋白氨基酸序列中的終止密碼子數(shù)目(8～9個(gè))要顯著多于四倍體小麥(4～6個(gè))。由于沒有前人確定性的結(jié)論，結(jié)合分析結(jié)果，我們推測，終止密碼子的出現(xiàn)可能會因染色體的組成而異,其具體規(guī)律有待進(jìn)一步的研究。

眾所周知，ω-醇溶蛋白明顯缺乏含硫氨基酸[12-13]，正是基于這種原因，ω-醇溶蛋白無法利用分子間二硫鍵參與形成更大的分子，所以對面包的品質(zhì)貢獻(xiàn)很小[5,13,22]。并且目前也有諸多報(bào)道指出，ω-醇溶蛋白的不合理缺失可能對小麥的品質(zhì)有著較大的負(fù)面效應(yīng)[25-27]。因此，為了提高小麥面粉的品質(zhì)，增加ω-醇溶蛋白中的含硫氨基酸明顯比敲除ω-醇溶蛋白基因更有益處。本研究中獲得的ω-醇溶蛋白序列中KR082150擁有了兩個(gè)甲硫氨酸，因此，我們可以利用其序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增含硫氨基酸的ω-醇溶蛋白，一方面可以搜集更多的含硫ω-醇溶蛋白進(jìn)行研究，另一方面還可以將更多的含硫ω-醇溶蛋白轉(zhuǎn)入普通小麥替換貧硫ω-醇溶蛋白。

由進(jìn)化樹分析可知，ω-醇溶蛋白分成了2個(gè)主要的分支：以丙氨酸(Ala)開頭的ω-醇溶蛋白聚在了一個(gè)大的分支中，包括ATN 、ARH、ARE和ARQ四種類型；另一個(gè)分支包括TRQ和SRL兩種類型。因此，ω-醇溶蛋白的類型在進(jìn)化中可能發(fā)揮著重要的作用，ω-醇溶蛋白以丙氨酸(Ala)開頭的可能來源相同，這為下一步研究ω-醇溶蛋白的進(jìn)化提供了研究方向。

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Cloning and Analysis of Novel ω-gliadin Sequences fromTriticumSpecies

LI Zenglin,WU Dandan,LI Hongyu,CHEN Gang,LIU Xiaojuan,NING Shunzong,LIU Dengcai,ZHANG Lianquan

(Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu,Sichuan 611130,China)

Abstract:In order to exploit the potential value of ω-gliadin in wheat quality breeding,two pairs of primers were used to amplify the ω-gliadins from T. timopheevi Zhuk. var. araraticum,T.turgidum ssp. dicoccon,T. timopheevi,T.monococcum ssp. monococcum and T.monococcum var. boeoticum. Six novel ω-gliadin sequences were isolated,which belonged to three types:ARH,ATN and TRQ.The lengths of 6 sequences varied from 927 to 1 095 bp. Only KR082150 has two methionines,and the others have no cysteines and methionines.Phylogenetic analysis indicated that ω-gliadin sequences obtained in this study were mainly divided into 2 branches.The ARH and ATN types of ω-gliadin sequences were clustered together in one branch,while TRQ type of ω-gliadin sequence was clustered in the other branch.

Key words:Triticum species; ω-gliadin; Gene cloning; Phylogenetic analysis

中圖分類號：S512.1；S330

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)03-0268-05

通訊作者：張連全(E-mail: zhanglianquan1977@126.com)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271723，31201210); 四川省杰出青年基金項(xiàng)目(2011JQ0016); 四川省教育廳項(xiàng)目(14ZA0012)

收稿日期：2015-11-04修回日期：2015-12-19

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160301.1338.004.html

第一作者E-mail: qlizenglinq@163.com(李增林); wudandan90@163.com(吳丹丹,與第一作者同等貢獻(xiàn))