鄧楚鐘, 潘耀振

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽　550001)

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同源重組與Gibson Assembly方法構(gòu)建腺病毒載體*

鄧楚鐘, 潘耀振*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科， 貴州 貴陽550001)

[摘要]目的： 對(duì)比同源重組與Gibson Assembly兩種方法構(gòu)建腺病毒載體的效率。方法： 增殖并提取AD4 DNA，分別用同源重組與Gibson Assembly兩種方法，將AD4 DNA鑲嵌入pBR322質(zhì)粒，構(gòu)建出攜帶有全長(zhǎng)AD4 DNA的腺病毒載體，并進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定，對(duì)比兩種方法構(gòu)建腺病毒載體的篩選效率。結(jié)果： 兩種方法均能構(gòu)建出正確的腺病毒載體；篩選同源重組法1 000個(gè)菌落中，鑒定360個(gè)，僅有1個(gè)菌落；Gibson Assembly法112個(gè)菌落數(shù)中，鑒定其中10個(gè)，有3個(gè)陽性。結(jié)論： Gibson Assembly方法比傳統(tǒng)同源重組方法在構(gòu)建腺病毒載體時(shí)更有效。

[關(guān)鍵詞]腺病毒； 疫苗； 重組載體； Gibson Assembly

腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，分子量為150 MDa，直徑約為950 ?，它是已知最大和最復(fù)雜的無包膜DNA病毒之一[1]。腺病毒廣泛存在于自然中，能通過呼吸道、消化道、眼黏膜等途徑感染動(dòng)物和人，無論增殖和非增殖細(xì)胞均可以被感染，但對(duì)人類的致病性低。由于腺病毒和人類基因組同源，感染后不會(huì)整合到人染色體中，不會(huì)導(dǎo)致染色體突變。因此，將腺病毒作為抗原呈遞載體構(gòu)建疫苗，具有高效、安全、給藥方便的優(yōu)點(diǎn)，可以激發(fā)機(jī)體天然免疫反應(yīng)，同時(shí)便于保存及成本易控[2-9]，這些優(yōu)勢(shì)使得腺病毒載體成為疫苗研究的熱點(diǎn)。同源重組方法構(gòu)建腺病毒載體是目前公認(rèn)的效率較高的方法，但由于受到36 Kd腺病毒DNA堿基數(shù)量過大影響，實(shí)際效率不高。Gibson Assembly方法是近些年由Dr. Daniel Gibson發(fā)明了一種新的方法，可以容易的將多個(gè)線性DNA片段組合到一起。本研究采用傳統(tǒng)同源重組與Gibson Assembly兩種方法對(duì)腺病毒載體進(jìn)行構(gòu)建，并做出對(duì)比與評(píng)價(jià)。

1材料和方法

1.1主要材料

質(zhì)粒pBR322、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌DY330、E1區(qū)、E3區(qū)、蛋白IX缺損的4型腺病毒以及Hela229細(xì)胞由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院8所提供，經(jīng)PCR及酶切鑒定無誤。質(zhì)粒提取試劑購(gòu)買于威格拉斯公司，電擊儀、1 mL電擊杯購(gòu)于Bio-Rad Micro pulserTM公司，Gibson Assembly Mix試劑購(gòu)買于NEB公司，Q5 Taq酶購(gòu)買于NEB公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)買于寶生物公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1腺病毒感染繁殖和DNA提取E1區(qū)、E3區(qū)、蛋白IX缺損的Ad4感染入Hela229細(xì)胞， 10%胎牛血清 EMEM 37 ℃溫箱培養(yǎng)72 h，使病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖。反復(fù)凍融數(shù)次，破壞細(xì)胞壁后收集至20 mL超濾管5 000 g離心30 min，使含有病毒的培養(yǎng)液濃縮。加入Baffer A 2 mL(100 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、12.5 mmol/L EDTA)到20 mL超濾管5 000 g離心，反復(fù)洗滌4次后加入等體積Baffer B(100 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、12.5 mmol/L EDTA、2%SDS)及1/50體積蛋白酶K，50 ℃反應(yīng)30 min。酚氯仿抽提及乙醇沉淀得到純凈的DNA。-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2同源重組方法構(gòu)建腺病毒載體

1.2.2.1腺病毒載體質(zhì)粒骨架(pBR-4VLR)構(gòu)建pBR322質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HindIII切成線性。用PCR擴(kuò)增兩條同源壁，一端(40 bp)與pBR322同源，另一端與AD4兩端同源。左臂長(zhǎng)974 bp，上游引物CTATCTATATAATATACCTTATTTTTTTTGTG，下游引物GACGAGCAGGCGATTCAGAAC；右臂長(zhǎng)853 bp，上游引物GCCTCAGGAACAACGATGGAA，下游引物CACAAAAAAAATAAGGTATATTATTGATGA。在DY330中同源重組，使同源臂鏈接在pBR322上。

1.2.2.2打靶感受態(tài)制備取5 μL DY330細(xì)胞接于5 mL無抗性培養(yǎng)液中，30 ℃搖床增殖12～16 h。取增殖后的菌液300 μL加入15 mL LB，30 ℃搖床培養(yǎng)2 h，42 ℃水浴搖床培養(yǎng)12 min，冰浴30 min，用離心機(jī)7 500 r/min和無菌水在4 ℃條件下洗滌3次。10%甘油重懸1 mL，4 ℃ 12 000 r/min離心機(jī)中再洗滌1次， 10%甘油200 μL重懸。

1.2.2.3同源重組取40μL感受態(tài)細(xì)胞、AD4 DNA10 ng和pBR-4VLR 1.5 ng于電擊杯中，電擊儀電擊。電擊打靶條件:電壓1.5 kV，電阻300 Ω，電容2.5 μF。加入無抗LB1 mL稀釋，取出500 μL涂瓊脂平板，置入30 ℃溫箱培養(yǎng)過夜，挑平板中單菌落作鑒定。見圖1。

圖1　同源重組法構(gòu)建腺病毒載體方法Fig.1　Illustration of homologous recombination in constructing adenovirus vector

1.2.3Gibson Assembly方法構(gòu)建腺病毒載體1.2.3.1原料擴(kuò)增pBR322為載體骨架，將3.6 kb的AD4 DNA分成AD-1、AD-2、AD-3、AD-4 4段，均用PCR方法擴(kuò)增，5段原料兩側(cè)均設(shè)計(jì)30 bp左右的同源臂。pBR 322段(2 kb)：Q5Taq，上游引物ATTATTGATGATGCGATCGCCATCGGTATCATTACCCCCATG，下游引物TATATTATTGATGATGCGATCGCGAATTCTTGAAGACGAAAGGGCC；條件為98 ℃預(yù)變性 5 min，98 ℃ 30 s、64 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min, 3個(gè)循環(huán); 98 ℃ 10 s、72 ℃ 1 min, 27個(gè)循環(huán); 最后 72 ℃延伸2 min。PCR 產(chǎn)物膠回收純化。AD-1段(8.6kb)：Q5Taq，上游引物CTATCTATATAATATACCTTATTTTTTTTGTGTGAGTTAATATGC，下游引物TGAGTTTGAACCTGAAAGACAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATC。AD-2段(10 kb)DNA模板AD4 DNA，Q5酶，上游引物ATTGACGGCGGCCTGCCGCAGAATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTG，下游引TGCCTAACAGACCCAACTACATTGGCTTCAGAGACAATTTTATCGG。AD-3段(10 kb)DNA模板AD4 DNA，Q5Taq，上游引物GCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCG，下游引物TTAGTGATTCTGAGGGGTATTATACCCAACATACTTTTATCT。AD-4段(7.4 kb)DNA模板AD4 DNA，Q5Taq，上游引物ATGACATTAAGGTCATACCATTGCCAACACCCAGCCCACCTAGCA，下游引物TTGCATATTAACTCACACAAAAAAAATAAGGTATATTATATAGATAG。條件為98 ℃預(yù)變性3 min; 98 ℃ 10 s、64 ℃ 30 s、72 ℃ 4 min, 30個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸2 min。PCR 產(chǎn)物膠回收純化。

1.2.3.2PCR產(chǎn)物鏈接在充分預(yù)冷前提下，快速以每種產(chǎn)物0.2～1 pmol/L濃度配備好溶液，再加無菌水至10 mL,并加入Gibson Assembly Mix酶10 μL，50 ℃反應(yīng)60 min，電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入DH5α。置入37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜。挑平板中單菌落作鑒定。見圖2。

圖2　Gibson Assembly方法構(gòu)建腺病毒載體方法Fig.2　Illustration of Gibson Assembly method in constructing adenovirus vector

2結(jié)果

2.1AD4 DNA制備

AD4感染Hela229細(xì)胞24 h后，顯微鏡下觀察見細(xì)胞變形、萎縮、凋亡，見圖3，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上。用超濾管濃縮后提取，可以從>20 mL的Ad4上清中提取DNA，產(chǎn)物濃度600～800 mg/L，產(chǎn)物體積每管20 μL。經(jīng)NotI、EcoRV、EcoRI、KpnIBamHI、HindIII、SmaI、XbaI酶切定酶切鑒定，證實(shí)DNA序列沒有出現(xiàn)大量斷裂和損傷,見圖4。

圖3　Ad4病毒培養(yǎng)(Hela229)Fig.3　Cultivation of Ad4 virus

2.2腺病毒載體鑒定

PCR鑒定，擴(kuò)增片段大小為750 bp(圖5)，同源重組及Gibson Assembly方法測(cè)序鑒定見圖6，結(jié)果正確。

圖4　NotI、EcoRV、EcoRI、KpnI BamHI、HindIII、SmaI、XbaI酶切鑒定Fig.4　Enzyme digestion of AD4 DNA by NotI,EcoRV,EcoRI, KpnI BamHI, HindIII, SmaI, XbaI

注：載體1為同源重組法，載體2為Gibson Assembly法圖5　PCR鑒定同源重組與Gibson Assembly方法構(gòu)建的腺病毒載體Fig.5　PCR identification of homologous recombination and Gibson Assembly method

注：A為同源重組法，B為Gibson Assembly法圖6　同源重組及Gibson Assembly方法構(gòu)建的腺病毒載體測(cè)序結(jié)果Fig.6　Sequence outcome of homologous recombination and Gibson Assembly method

2.3篩選效率

如表1所示，同源重組方法的篩選效率低于Gibson Assembly方法。

表1　同源重組方法與Gibson Assembly方法

3討論

基因治療是近幾十年來發(fā)展起來的一種治療疾病的手段,已經(jīng)成功地應(yīng)用于臨床[10]。它通過基因的轉(zhuǎn)移來預(yù)防和治療疾病,尤其在疫苗、腫瘤及遺傳性疾病方面, 應(yīng)用前景十分突出?；蛑委熤?基因傳遞系統(tǒng)是研究的重點(diǎn)，如何把特異性基因快速、高效的導(dǎo)入相應(yīng)的靶細(xì)胞，不僅是研究特定基因的結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)調(diào)控的重要手段,也是基因治療的關(guān)鍵[11]。基因傳遞系統(tǒng)中應(yīng)用的載體分為非病毒方式和病毒方式[12]。非病毒方式載體在基因治療中應(yīng)用較少，它的優(yōu)點(diǎn)在于沒有病毒的致病性,因此機(jī)體不會(huì)導(dǎo)致明顯的免疫反應(yīng),相對(duì)安全 ,缺點(diǎn)在于目的DNA轉(zhuǎn)染效率低,即使轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，也容易被細(xì)胞內(nèi)DNA酶降解,導(dǎo)致為數(shù)不多的目的基因無法穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)并高效表達(dá)。目前，絕大多數(shù)的基因治療的方案中都使用病毒載體介導(dǎo)目的基因，主要優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率高,目的基因表達(dá)穩(wěn)定；病毒載體可剪除一些致病基因序列，改造成低致病性的缺陷型病毒，使得用病毒載體的基因治療更加安全。用于基因治療的常用載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體 、腺病毒相關(guān)病毒載體 、單純皰疹病毒載體以及嵌合病毒載體等[13]。

腺病毒載體構(gòu)建完成，只需將目的基因插入到病毒基因組中預(yù)先缺損的E1區(qū)、E3區(qū)、蛋白IX三個(gè)區(qū)域，感染到細(xì)胞內(nèi)，就可使用能表達(dá)目的基因的重組腺病毒制成的藥物，發(fā)揮作用。如插入CTB(霍亂弧菌腸毒素的B亞基)，構(gòu)建出霍亂疫苗，插入HBsAg(乙肝病毒表面抗原)構(gòu)建出乙肝疫苗。具體效果取決于抗原類型和插入的區(qū)域。從目前臨床應(yīng)用來看，由正常人p53腫瘤抑制基因和改構(gòu)的5型腺病毒基因重組而成的世界上第一個(gè)上市的腫瘤基因治療藥物，即重組人p53腺病毒注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字S20040004)已于2012年在中國(guó)生產(chǎn)[14]。重組人p53腺病毒中p53基因是發(fā)揮腫瘤治療作用的主體結(jié)構(gòu)，腺病毒為載體，腺病毒載體承載p53治療基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。實(shí)踐證實(shí)腺病毒載體承載基因效果明顯，而且相對(duì)其它手段還具有安全、給藥方便等特點(diǎn)。可用于制藥、基因工程疫苗、基因治療以及腫瘤治療等領(lǐng)域，有很高的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值，前景非常寬廣。

同源重組方法是目前使用很多的方法，它是基于pBR322通過PCR引物在質(zhì)粒的兩端加上同源臂構(gòu)建出質(zhì)粒骨架pBR-4VLR，利用DY330的Red重組酶(由Gam、Bet、Exo 3個(gè)亞基組成)，使E1區(qū)、E3區(qū)、蛋白IX缺損的線性的AD4 DNA在大腸桿菌內(nèi)與質(zhì)粒發(fā)生序列特異的發(fā)生同源重組，制作成腺病毒載體。同源重組法利用Red重組酶，能快速、精確的將AD4 DNA引入質(zhì)粒骨架中，但篩選時(shí)易出現(xiàn)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，背景值很高?？紤]原因?yàn)橄俨《綝NA序列較長(zhǎng)，使質(zhì)粒骨架對(duì)其捕捉時(shí)效率降低。

Gibson Assembly方法不用考慮片段的長(zhǎng)度或者末端的互補(bǔ)性，將多個(gè)具有重合區(qū)的DNA片段放在一個(gè)單溫反應(yīng)管里就可以實(shí)現(xiàn)片段的連接。在T5外切酶、Phusion DNA聚合酶、Taq DAN連接酶的作用下，用PCR擴(kuò)增的5段DNA片段連接成一個(gè)完全的雙鏈DNA分子，制作成相同的腺病毒載體。制作中不僅減少了同源重組方法中的很多工序，降低了操作難度還節(jié)約時(shí)間。腺病毒載體的鑒定中，只有較少菌落，并且很容易就得到了正確的菌落。最重要的是同源重組等方法構(gòu)建出腺病毒載體后需要將目的基因采用雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染等方法插入腺病毒載體中，而 Gibson Assembly方法則只需將目的基因和其它DNA片段一起用PCR擴(kuò)增出來，再共同一管反應(yīng)，直接連接在一起。非常高效、靈活。

從載體篩選來說，同源重組的假陽性結(jié)果非常多，背景值較高，篩選很困難。而Gibson Assembly方法讓我們獲得了滿意的效率。從載體的構(gòu)建方面看Gibson Assembly方法明顯比傳統(tǒng)的同源重組更加簡(jiǎn)單、快捷和方便，由于可以將多條DNA片段同時(shí)連接，Gibson Assembly更加靈活多變。Gibson Assembly這種新方法的簡(jiǎn)單、高效、多變，在腺病毒載體構(gòu)建方面表現(xiàn)出了非常好的前景。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)腺病毒疫苗載體構(gòu)建方法做了構(gòu)想、設(shè)計(jì)、實(shí)際操作、對(duì)比及評(píng)論，利用目前應(yīng)用最多的同源重組方法和近年來開發(fā)但并未應(yīng)用于腺病毒載體構(gòu)建中的Gibson Assembly方法進(jìn)行實(shí)際操作、評(píng)估，得到了Gibson Assembly方法相比其他方法更具優(yōu)勢(shì)的理論和數(shù)據(jù)支持。希望能為此領(lǐng)域的研究提供依據(jù)，為下一步的研究和改進(jìn)工作提供數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。

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(2016-01-05收稿，2016-03-28修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

Comparison between Homologous Recombination and Gibson Assembly Method in Constructing Adenovirus Vectors

DENG Chuzhong, PAN Yaozhen

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550001,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To compare the efficiency of traditional homologous recombination method with Gibson Assembly method in constructing adenovirus vector. Methods: AD4 DNA was proliferated and extracted, and inlaid AD4 into the pBR322 DNA plasmid and constructed adenovirus vector with total length of the AD4 DNA by homologous recombination method or Gibson Assembly method, which was amplified by PCR and sequenced for identification. Then, the efficiency of two methods was compared. Results: Both methods could construct the adenovirus vector of right sequence. There were over 1 000 colonies in the plate using homologous recombination method, among which 360 colonies were identified and there was only one positive result. Although there were only 112 colonies in the plate using Gibson Assembly, 10 colonies among then were identified and there were three positive results. Conclusion: Gibson Assembly method is more efficient than traditional homologous recombination method in constructing adenovirus vector.

[Key words]adenovirus; vaccine; recombination vector; Gibson Assembly

[中圖分類號(hào)]R346

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)04-0430-06

*通信作者E-mail:527089839@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1825.032.html