唐艷芬，高　想，蔣鳳榮，郭　勝，蘇成程，侯海慧

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023)

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金蕎麥提取物對COPD大鼠血清炎癥因子和NF-κB表達的影響

唐艷芬1，高想1，蔣鳳榮2，郭勝1，蘇成程1，侯?；?

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023)

[摘要]目的觀察金蕎麥提取物對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠血清炎癥因子和核因子NF-κB的影響，探討其治療COPD的可能機制。方法采用改良煙熏法復(fù)制SD大鼠COPD模型，將造模成功大鼠隨機分為模型組，金蕎麥水提取物低、高劑量組，金蕎麥醇提取物低、高劑量組，每組6只；另取6只正常大鼠作為正常組。正常組和模型組灌胃生理鹽水，高劑量組給予水提物或醇提物10 g/kg(相當(dāng)生藥10倍)灌胃，低劑量組給予水提物或醇提物5 g/kg(相當(dāng)生藥5倍)灌胃，均1次/d，持續(xù)灌胃21 d。放射免疫法測定血清腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)水平，免疫組織化學(xué)法檢測氣管組織中核因子NF-κB表達情況。結(jié)果模型組血清TNF-α、IL-8、IL-6水平明顯高于正常組(P均<0.05)；金蕎麥水提物低劑量組、水提物高劑量組、醇提物低劑量組、醇提物高劑量組血清TNF-α、IL-8、IL-6水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；與金蕎麥水提物同等劑量組比較，醇提物組下降更顯著(P>0.05)。模型組NF-κB表達陽性個數(shù)顯著高于正常組(P<0.05)，金蕎麥各提取物組NF-κB 表達陽性個數(shù)明顯低于模型組(P均<0.05)，其中金蕎麥醇提物高劑量組NF-κB 表達陽性個數(shù)最少。結(jié)論金蕎麥水提物和醇提物均可下調(diào)NF-κB的表達，抑制COPD大鼠炎癥反應(yīng)，延緩COPD的發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]金蕎麥；慢性阻塞性肺疾??；細胞因子；核因子

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種具有氣流受限特征的疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發(fā)展，與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)炎癥細胞、炎癥遞質(zhì)及細胞因子參與了氣道壁的受損和肺組織的破壞[1]。近年來對COPD的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥辨證施治可對COPD發(fā)生發(fā)展的多個層次、多個環(huán)節(jié)發(fā)揮效應(yīng)[2]，為COPD的防治提供了新的思路和方法。金蕎麥水劑為南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院制劑，臨床用于治療COPD急性加重患者療效較好[3-5]，但其作用機制尚不明確。本研究通過觀察金蕎麥提取物對COPD大鼠血清炎癥因子及核因子NF-κB表達的影響，探討了其治療COPD的機制。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1實驗資料

1.1動物3月齡SD雄性大鼠38只，SPF級，體質(zhì)量(200±10)g。南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號：SYXK(蘇)2012-0042，動物質(zhì)量合格證號：0012537。

1.2試劑腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)放免試劑盒由北京華英生物有限公司提供，抗體由美國B&R公司提供，引物由南京生物工程有限公司合成，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3金蕎麥提取物制備金蕎麥飲片(南通三越中藥飲片有限公司，批號：20120128)60 ℃干燥8 h，粉碎，過100目篩，混勻，加70%乙醇100 L浸泡12 h，熱回流提取2 h，過濾；重復(fù)提取2次，合并提取液，回收溶劑至無醇味；后加三氯甲烷提取，水液繼續(xù)用水飽和正丁醇提取，得到三氯甲烷提取液，水飽和正丁醇提取液和水提取液，分別回收溶劑，真空干燥至浸膏，得到水提物和醇提物。

1.4實驗方法隨機選取32只大鼠，參照《醫(yī)學(xué)動物實驗方法學(xué)》，采用改良煙熏法復(fù)制COPD模型：將大鼠置于特制的50 cm×50 cm×50 cm的煙室中，將刨花鋸末、煙葉各20 g點燃熏煙，2次/d，每次30 min，持續(xù)30 d，在實驗第7,15天，以3%戊巴比妥45 mg/kg 腹腔麻醉后，仰臥位固定大鼠，行頸部脫毛，做頸部正中切口并分離頸前肌，暴露氣管，向氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS，10 mg/瓶，購自美國Sigma公司，用無菌注射用水制成水溶液1 mg/mL)200 μL,完畢后迅速將大鼠直立旋轉(zhuǎn)10～20 s，使生理鹽水均勻分布于肺部。另選取6只大鼠作為正常組，置于正常無煙環(huán)境中飼養(yǎng)，第7,15天同樣手術(shù)，向氣管內(nèi)注入無菌生理鹽水200 μL。于造模30 d處死2只大鼠判斷造模是否成功。將30只造模成功大鼠隨機分為模型組、金蕎麥水提物低劑量組、金蕎麥水提物高劑量組、金蕎麥醇提物低劑量組、金蕎麥醇提物高劑量組，每組6只。于造模結(jié)束后第2天起，正常組和模型組灌胃生理鹽水10 mL/kg，高劑量組給予水提物或醇提物10 g/kg(相當(dāng)生藥10倍)灌胃，低劑量組給予水提物或醇提物5 g/kg(相當(dāng)生藥5倍)灌胃，均1次/d，持續(xù)灌胃21 d。

1.5檢測指標(biāo)

1.5.1血清TNF-α、IL-6、IL-8水平實驗結(jié)束后，取動物血清，放射免疫法檢測血清TNF-α、IL-6、IL-8水平。

1.5.2氣管組織中NF-κB表達情況采用免疫組織化學(xué)方法檢測。實驗結(jié)束后，處死動物，取出支氣管和氣管置于10%甲醛溶液中，常規(guī)脫水、切片。將石蠟切片用PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30 min；PBS沖洗，每張切片加1滴3%過氧化氫阻斷溶液,以阻斷內(nèi)源性過氧物酶的活性,室溫下孵育10 min；PBS沖洗，每張切片加1滴的非免疫性動物血清,室溫下孵育20 min；甩去血清,每張切片加1滴的第一抗體(1∶100)，4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次5 min；甩去PBS液,每張切片加1滴生物素標(biāo)記的第二抗體(生物素山羊抗兔IgG),室溫下孵育10 min；PBS沖洗3次，每次3 min；甩去PBS液,每張切片加l滴SABC，室溫下孵育20 min；PBS沖洗3次，每次3 min；甩去PBS液,每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液,顯微鏡下觀察3～10 min；陽性反應(yīng)為胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒，并在高倍視野下計算100個細胞中陽性細胞數(shù)，選3個高倍視野計算均值。

2結(jié)果

2.1各組血清TNF-α、IL-8、IL-6水平模型組血清TNF-α、IL-8、IL-6水平明顯高于正常組(P均<0.05)；金蕎麥水提物低劑量組、水提物高劑量組、醇提物低劑量組、醇提物高劑量組血清TNF-α、IL-8、IL-6水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；金蕎麥水提物與醇提物同等劑量組比較，醇提物組下降更多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組血清TNF-α、IL-8、IL-6水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05 ；②與模型組比較，P<0.05。

2.2各組氣管組織中NF-κB表達情況正常組有極少量棕黃色顆粒，模型組大量棕黃色顆粒，金蕎麥水提物低、高劑量組有一定量棕黃色顆粒，金蕎麥醇提物高劑量組有少量棕黃色顆粒。見圖1～6。正常組、模型組、金蕎麥水提物低劑量組、金蕎麥水提物高劑量組、金蕎麥醇提物低劑量組、金蕎麥醇提物高劑量組NF-κB表達陽性個數(shù)分別為(3.83±0.75)個/100個、(14.00±1.79)個/100個、(11.00±0.89)個/100個、(6.33±0.82)個/100個、(9.67±0.52)個/100個、(5.83±0.75)個/100個。模型組NF-κB表達陽性個數(shù)顯著高于正常組(P<0.05)，金蕎麥各提取物組NF-κB表達陽性個數(shù)均明顯低于模型組(P均<0.05)，其中金蕎麥醇提物高劑量組NF-κB表達陽性個數(shù)最少。

圖1　正常組氣管組織中NF-κB表達情況(×200)

圖2　模型組氣管組織中NF-κB表達情況(×200)

圖3　金蕎麥水提物低劑量組氣管組織中NF-κB表達情況(×200)

圖4　金蕎麥水提物高劑量組氣管組織中NF-κB表達情況(×200)

3討論

COPD發(fā)病機制尚不清楚,目前認為該病以氣道、肺實質(zhì)和肺小血管的慢性炎癥為特征,病理改變包括慢性炎癥及支氣管、肺的反復(fù)損傷和機體不恰當(dāng)修復(fù)而導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)改變。近年來大量研究表明TNF-α、IL-6、IL-8等細胞因子在COPD的發(fā)病中有一定作用[6-7]。IL-8主要來源于單核細胞、血管內(nèi)皮細胞、T淋巴細胞，具有廣泛的生物學(xué)活性[8]，是重要的白細胞趨化因子，主要吸引中性粒細胞(PMN)，通過與表面特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致其趨化、變形，脫顆粒反應(yīng)，釋放彈性蛋白酶、組織蛋白酶等，引起嚴(yán)重的組織損傷。而彈性蛋白酶的釋放又能誘導(dǎo)氣道上皮細胞IL-8基因的表達，導(dǎo)致IL-8的進一步分泌，形成氣道內(nèi)的“炎性循環(huán)”，造成組織損傷，引起氣道壁增厚和管腔狹窄，導(dǎo)致氣流阻塞。TNF-α是一種強有力的致炎因子，其能激活炎性白細胞，尤其是巨噬細胞和PMN，可以刺激其釋放更多的氧和氮基團以及其他細胞因子，如IL-6、IL-8和其他炎性細胞趨化因子[8]，這些遞質(zhì)能破壞肺的結(jié)構(gòu)和/或促進PMN炎癥反應(yīng)[9]。本實驗結(jié)果顯示，模型組血清TNF-α、IL-8、IL-6水平明顯高于正常組，提示這些細胞因子與COPD氣道炎癥密切相關(guān)。金蕎麥水提物低、高劑量組和醇提物低、高劑量組血清TNF-α、IL-8、IL-6水平均明顯低于模型組；水提物與醇提物同等劑量比較，醇提物組下降更多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示金蕎麥水提物及醇提物均可降低血清TNF-α、IL-8、IL-6水平，具有一定的抑制COPD氣道炎癥的作用，相同提取方法以高劑量組作用明顯，不同提取方法等劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5　金蕎麥醇提物低劑量組氣管組織中NF-κB表達情況(×200)

圖6　金蕎麥醇提物高劑量組氣管組織中NF-κB表達情況(×200)

NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄因子,其參與多種細胞因子和炎癥遞質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及表達，在免疫細胞的活化、分化、增殖以及各種炎癥、細胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)當(dāng)中均具有非常重要的功能，廣泛參與COPD肺內(nèi)多種因子的調(diào)控，其可以通過誘導(dǎo)多種細胞因子如IL-6、TNF-α、IFN-8等而可能引發(fā)“炎癥瀑布”效應(yīng)[10]。研究發(fā)現(xiàn),NF-κB p65在氣道上皮細胞中的表達與氣道氣流受限程度、COPD病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組NF-κB表達水平顯著高于正常組，金蕎麥各提取物組NF-κB表達水平明顯低于模型組，其中金蕎麥醇提物高劑量組NF-κB表達水平最低。提示金蕎麥提取物能夠在一定程度上抑制NF-κB的表達，進而推斷其能夠減少下游各炎癥因子的分泌，從而截斷了患者的炎癥反應(yīng)，能夠延緩COPD疾病的發(fā)展。

綜上所述，金蕎麥水提物和醇提物均可下調(diào)NF-κB的表達，抑制COPD大鼠炎癥反應(yīng)，相同提取方法以高劑量組作用明顯，醇提物組較水提物組作用明顯。結(jié)合COPD為多因素、多因子參與的發(fā)病特點, 推測轉(zhuǎn)錄因子可能是COPD發(fā)病中多種遞質(zhì)因子表達的基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，金蕎麥提取物通過抑制NF-κB表達而抑制COPD大鼠的氣道炎癥，在目前COPD尚無特效治療的情況下,通過激活或抑制NF-κB的表達, 以提高或降低某種遞質(zhì)或因子的表達來治療COPD不失為一種可嘗試的、新的思路和方法。

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Effect of the Wild Buckwheat Rhizome Extract on the serum inflammatory cytokines and the expression of NF-κB in chronic obstructive pulmonary disease model of rats

TANG Yanfen1, GAO Xiang1, JIANG Fengrong2, GUO Sheng1, SU Chengcheng1, HOU Haihui1

(1. Nantong Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nantong 226001, Jiangsu, China; 2. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of the Wild Buckwheat Rhizome Extract on the serum inflammatory cytokines and the expression of NF-κB in chronic obstructive pulmonary disease model of rats, and explore the therapeutic mechanism for COPD. Methods The COPD model of SD rats was reproduced by improved smoke method, and then the successful model rats were randomly divided into model group, low (LAE group) and high (HAE group) dose group of aqueous extract of Wild Buckwheat Rhizome, low (LEE group) and high (HEE group) dose group of ethanol extract of Wild Buckwheat Rhizome, 6 rats in each group, another 6 rats were taken as normal group. The animals were treated with normal saline by gavage in the normal group and model group, and with water or ethanol extract of 10 g /kg (10 times drug) in the high dose groups, and water or ethanol extract of 5 g/kg (a drug 5 times) in the low dose groups, all 1 times per day, continuous treated for 21 days. The levels of serum tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin -6 (IL-6) and interleukin -8 (IL-8) were measured by radioimmunoassay, and the expression of NF-κB in tracheal tissue were detected by immunohistochemical method. Results The serum levels of TNF-α, IL-6 IL-8 in the model group were significantly higher than those in the normal group (all P<0.05); the serum levels of TNF-α, IL-6 IL-8 in the LAE group, HAE group, LEE group, and HEE group were significantly lower than those in the model group (all P<0.05). There was no significant difference in the levels between the same dose of ethanol extract and aqueous extract groups (all P>0.05). The expression of NF-κB in the model group was significantly higher than that in the normal group (P<0.05), the expressions of NF- κB in the extract groups of Wild Buckwheat Rhizome were significantly lower than those in the model group (all P<0.05), and the levels in the HEE group was the lowest. Conclusion The extraction of Wild Buckwheat Rhizome can reduce the expression of NF-κB, inhibit the inflammatory response in COPD rats and improve the lung pathomorphism changes.

Key words:Wild Buckwheat Rhizome; chronic obstructive pulmonary disease; serum Cytokine; nuclear factor

[收稿日期]2015-09-15

[中圖分類號]R-332

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)15-1600-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.15.002

[基金項目]江蘇省中醫(yī)藥局中醫(yī)藥科技專項課題(LB09113)

[作者簡介]唐艷芬，女，主任醫(yī)師，研究方向為慢性阻塞性肺疾病及肺源性心臟病。