付魏魏 何秀英 劉維 程永盛 盧東柏 林菲 廖耀平 陳釗明 陳粵漢 王玲

摘 要 粵標(biāo)5號(hào)是應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)育成的抗病優(yōu)質(zhì)水稻新品種，應(yīng)用水稻12條染色體的237對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)該品種的遺傳背景進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：93個(gè)標(biāo)記在親本間有明顯的多態(tài)性，多態(tài)性比例為39.2%；在各染色體上，基因型來自輪回親本的比例為30.0%～100.0%，來自供體親本的比例為0.0～70.0%；除染色體1和9外，該品種在其它染色體上均與輪回親本存在不同程度的差異位點(diǎn)，背景回復(fù)率為83.3%，低于理論回復(fù)率。此外，對(duì)粵標(biāo)5號(hào)的農(nóng)藝性狀分析表明，該品種有多個(gè)性狀介于雙親之間，但在每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、粒型等與輪回親本存在極顯著差異。研究結(jié)果將為水稻抗病分子育種提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 水稻；品種；遺傳背景；農(nóng)藝性狀

中圖分類號(hào) S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

稻瘟病是廣東水稻的主要病害之一，選育抗病品種是控制該病害最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多抗病基因被鑒定和克隆，為分子標(biāo)記輔助選擇培育抗病新品種奠定了良好的基礎(chǔ)[1]。迄今，已鑒定的稻瘟病主效抗病基因超過84個(gè)，成簇地分布于除第3染色體外的所有水稻染色體上（http：//www.ricedata.cn/）。近年來，基因聚合育種在水稻抗病育種中取得了較好的進(jìn)展。如柳武革等[2-3]育成攜帶抗病基因Pi1的不育系吉豐A和攜帶抗病基因Pi1、Pi2的不育系安豐A，2011年通過廣東省技術(shù)鑒定；Jiang等[4]應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇將稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2、D12聚合于三系雜交稻保持系Jin 23B中，獲得稻瘟病抗性改良的Jin 23B；孫大元等[5]通過回交及自交，并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，育成攜帶稻瘟病抗性基因Pi46的雜交水稻恢復(fù)系航恢1173。

粵標(biāo)5號(hào)是利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)與常規(guī)水稻育種技術(shù)相結(jié)合的方法，將稻瘟病廣譜抗病基因Pi2聚合于廣東主栽品種粵豐占，經(jīng)回交和自交加代育成的高抗稻瘟病的水稻新品種，并于2015年通過廣東省品種審定，品種審定編號(hào)為“粵審稻2015031”（http：//www.gdrice.cn/）。該品種高抗稻瘟病，豐產(chǎn)性較好，米質(zhì)達(dá)國標(biāo)優(yōu)質(zhì)1級(jí)、省標(biāo)優(yōu)質(zhì)1級(jí)，抗倒性強(qiáng)，適合廣東及華南稻區(qū)作雙季稻種植。為了闡明該品種獲得的分子基礎(chǔ)，本研究均勻地選取水稻12條染色體的SSR標(biāo)記對(duì)粵標(biāo)5號(hào)的遺傳背景進(jìn)行分析，同時(shí)比較該品種與雙親主要農(nóng)藝性狀的差異，以期為有效地利用分子標(biāo)記輔助選擇培育抗病新品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

粵豐占為廣東省的優(yōu)質(zhì)稻主栽品種，2003年通過國家品種審定，豐產(chǎn)性好，米質(zhì)較優(yōu)，但不抗稻瘟?。╤ttp：//www.ricedata.cn/）；C101A51是攜帶稻瘟病廣譜抗病基因Pi2的單基因系，由國際水稻研究所構(gòu)建[6]；粵標(biāo)5號(hào)是本課題組與華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院合作利用以上2個(gè)親本材料育成的高抗稻瘟病水稻新品種，粵豐占為輪回親本，C101A51為基因供體親本。

1.2 方法

1.2.1 遺傳背景分析 （1）SSR分子標(biāo)記。根據(jù)Temnykh[7]和Gramene網(wǎng)站（http：//www.gramene.org）公布的標(biāo)記，按照一定的距離從水稻12條染色體上選取237個(gè)SSR標(biāo)記用于遺傳背景分析，并用MapChart 2.1軟件將這些標(biāo)記繪于水稻染色體上（圖1）。

（2）DNA提取及PCR反應(yīng)。采取新鮮的水稻葉片，用CTAB法提取樣本DNA。引物序列由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。15 μL PCR反應(yīng)體系中含有：1.0 μL的樣本DNA溶液，1.5 μL的10×PCR buffer，0.5 μL的10 mmol/L dNTPs，10 μmol/L的正負(fù)引物各0.5 μL，0.5 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL），其余由ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min（注：退火溫度因引物堿基含量而異）。擴(kuò)增產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，隨后銀染顯色觀察。

（3）背景恢復(fù)率。采用Hospital等[8]提出的方法估算回復(fù)率：G（g）=[L+X（g）]/（2L），其中G（g）為在g代的遺傳背景回復(fù)率，X（g）為在回交g代表現(xiàn)為輪回親本帶型的分子標(biāo)記數(shù)量，L為所分析的分子標(biāo)記數(shù)量。理論上的遺傳背景恢復(fù)率計(jì)算：G（g）=1-（1/2）g+1，其中g(shù)為回交世代。

1.2.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查 2015年在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豐實(shí)驗(yàn)基地，按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每重復(fù)插5行，每行20株，規(guī)格20.0 cm×16.7 cm。常規(guī)肥水管理。田間調(diào)查抽穗期、有效穗、株高，成熟后取中間10 株考種穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、粒型、單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Excel和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種選育雙親的多態(tài)性

選用覆蓋水稻全基因組的237對(duì)SSR引物對(duì)粵標(biāo)5號(hào)品種選育雙親粵豐占、C101A51進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，93個(gè)標(biāo)記在親本間具有明顯的多態(tài)性，多態(tài)性的比例為39.2%。多態(tài)性標(biāo)記除1、12染色體偏少外，比較均勻地分布于水稻12條染色體上。圖1是用MapChart 2.1軟件將本研究用于遺傳背景分析的237個(gè)SSR標(biāo)記繪于水稻染色體中，加“_”的標(biāo)記在雙親間具有多態(tài)性。染色體分析的總長(zhǎng)度為1749.3 cM，標(biāo)記間的平均長(zhǎng)度7.4 cM，各染色體的多態(tài)性標(biāo)記數(shù)平均為7.8個(gè)（表1）。

2.2 粵標(biāo)5號(hào)的遺傳背景分析

2.2.1 基因型分析情況 用親本間多態(tài)性的分子標(biāo)記分析粵標(biāo)5號(hào)的遺傳背景，根據(jù)帶型確定基因型。圖2分別是染色體1的SSR標(biāo)記RM583、染色體3的標(biāo)記RM7和RM218、染色體6的標(biāo)記RM527、染色體8的標(biāo)記RM331和染色體11的標(biāo)記RM206的PCR擴(kuò)增電泳圖。從圖中可以看出，在多態(tài)性位點(diǎn)粵標(biāo)5號(hào)的基因型分別與親本粵豐占，或C101A51相同。

表1列出了利用多態(tài)性SSR標(biāo)記解析粵標(biāo)5號(hào)的基因型情況。從水稻12條染色體的分析看，粵標(biāo)5號(hào)基因型來自輪回親本粵豐占位點(diǎn)的比例為30.0%～100.0%，來自供體親本C101A51位點(diǎn)的比例為0.0～70.0%。由此可見，該品種的基因型主要來自于輪回親本粵豐占。染色體間比較，在染色體1和9，粵標(biāo)5號(hào)基因型100%來自于輪回親本粵豐占；在染色體2～8、染色體10～12，雙親的基因型在粵標(biāo)5號(hào)中都各占一定的比例，如在染色體8中雙親的基因型各占50%，在染色體3中基因型來自粵豐占的位點(diǎn)比例最少，僅為30.0%，來自C101A51的比例為70.0%。

3.2.2 遺傳背景回復(fù)率 粵標(biāo)5號(hào)選育經(jīng)歷了4次回交和5次自交加代，輪回親本為粵豐占，基因供體親本為C101A51。本研究在應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳背景分析時(shí)，用“1”和“2”分別表示親本粵豐占、C101A51的基因型（表2）。在檢測(cè)的93個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，粵標(biāo)5號(hào)與粵豐占相同的位點(diǎn)數(shù)為62，與C101A51相同有位點(diǎn)（即差異位點(diǎn)）為31。除染色體1和9外，粵標(biāo)5號(hào)在其它染色體上均與輪回親本粵豐占存在不同程度的差異位點(diǎn)。根據(jù)Hospital等[8]提出的方法估算，粵標(biāo)5號(hào)的背景回復(fù)率為83.3%，低于理論回復(fù)率96.9%。

3.3 粵標(biāo)5號(hào)的農(nóng)藝性狀分析

對(duì)粵標(biāo)5號(hào)和其雙親的主要農(nóng)藝性狀分別進(jìn)行田間調(diào)查和取樣考種，結(jié)果見表3。粵標(biāo)5號(hào)的播始?xì)v期為73 d，與輪回親本粵豐占一樣；株高為96.5 cm，介于雙親之間；單株有效穗數(shù)7.9、穗長(zhǎng)23.1 cm，均高于雙親；每穗粒數(shù)137.2，高于親本C101A51，但顯著低于親本粵豐占；結(jié)實(shí)率81.3%和千粒重23.2 g，均高于或極顯著高于雙親；粒型為3.1與單株產(chǎn)量19.9 g，介于雙親之間。根據(jù)單株產(chǎn)量，按每666.7 m2種植水稻2.4萬株計(jì)，平均產(chǎn)量可估算為477.6 kg/666.7 m2。由此可見，粵標(biāo)5號(hào)有多個(gè)農(nóng)藝性狀介于雙親之間，但在每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、粒型等與輪回親本存在極顯著差異，在株高、結(jié)實(shí)率、粒型、單株產(chǎn)量等與供體親本存在顯著或極顯著差異。

4 討論與結(jié)論

粵標(biāo)5號(hào)是一個(gè)高抗稻瘟病、米質(zhì)優(yōu)、豐產(chǎn)性較好的水稻新品種，其品種選育的輪回親本為秈稻粵豐占，抗病基因供體親本為單基因系C101A51。稻瘟病抗病基因Pi2來源于南美秈稻5173[9]，攜帶Pi2的單基因系C101A51是國際水稻研究所以秈稻CO39為受體創(chuàng)建的[6]，因此，C101A51亦為秈稻。在本研究結(jié)果中，從水稻12條染色體均勻地選取了237對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)粵標(biāo)5號(hào)的親本粵豐占與C101A51進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選到93個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，多態(tài)性比例僅為39.2%，親本間的多態(tài)性不高，這個(gè)結(jié)果應(yīng)該與粵豐占和C101A51均為秈稻有關(guān)。

分子標(biāo)記輔助育種目前主要應(yīng)用于2個(gè)方面：一方面，多應(yīng)用于回交育種，利用外源有利基因改良現(xiàn)有品種；另一方面，用于基因聚合，利用與目標(biāo)基因共分離或緊密連鎖的分子標(biāo)記將數(shù)個(gè)基因聚合到一個(gè)品種中，使品種在多個(gè)方面同時(shí)得到改良[10]。本研究品種粵標(biāo)5號(hào)的選育是應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇與系譜選育相結(jié)合的方法，經(jīng)4次回交、5次自交加代選育而成。該品種聚合了稻瘟病廣譜抗病基因Pi2，抗病基因型純合，病區(qū)及接種鑒定均表現(xiàn)為高抗稻瘟病。因此，分子標(biāo)記與傳統(tǒng)的育種技術(shù)相結(jié)合可提高品種的選育效率，是目前水稻抗病育種技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要方向。

在應(yīng)用回交育種技術(shù)進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇時(shí)，通常會(huì)存在這樣的現(xiàn)象：如果回交代數(shù)多，則選育材料與輪回親本過于相象，遺傳差異小，育成材料綜合性狀難于取得較大突破；如果回交代數(shù)少，則育種群體的遺傳差異大，目標(biāo)性狀改良的難度高。因此，應(yīng)用回交方法進(jìn)行品種選育時(shí)，回交的代數(shù)應(yīng)適度，建議以回交3～4代為宜?；洏?biāo)5號(hào)的選育經(jīng)歷了4次回交，在品種選育過程中，除應(yīng)用緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選目標(biāo)抗性基因外，對(duì)檢測(cè)到攜帶抗病基因的株系，加強(qiáng)了農(nóng)藝性狀的篩選。從本研究的結(jié)果分析可得，該品種有多個(gè)性狀如每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、粒型等與輪回親本存在顯著差異，遺傳背景回復(fù)率低于理論值。但粵標(biāo)5號(hào)綜合性狀好，不僅聚合了目標(biāo)的抗病基因，表現(xiàn)為高抗稻瘟病，且米質(zhì)達(dá)國標(biāo)優(yōu)質(zhì)1級(jí)、株高適中、穗較長(zhǎng)，結(jié)實(shí)率高，豐產(chǎn)性較好。本研究的分析結(jié)果將為水稻抗病分子育種提供參考依據(jù)。

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