嚴(yán)華兵 周慧文 曾文丹

摘 要 以木薯主栽品種‘華南205組培苗為材料，利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）分析蔗糖濃度、萘乙酸（NAA）、多效唑（PP333）和茉莉酸甲酯（MeJA）對(duì)木薯試管塊根誘導(dǎo)的影響，篩選適宜木薯試管塊根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方，并對(duì)較優(yōu)配方組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)和根系內(nèi)淀粉粒觀察。結(jié)果表明：木薯試管塊根誘導(dǎo)較優(yōu)的配方為1/2 MS+6-BA 0.02 mg/L+0.1 mg/L PP333+0.02 mg/L NAA+10 μmol/L MeJA+50 g/L蔗糖+6.3 g/L瓊脂。在該配方誘導(dǎo)條件下，組培苗生根率達(dá)80%以上，組培苗形成的根系增粗明顯，塊根內(nèi)有豐富的淀粉顆粒形成。PP333在木薯試管塊根誘導(dǎo)和增粗中起著重要作用。本研究成功獲得了較優(yōu)的木薯試管塊根誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，為木薯塊根發(fā)生發(fā)育機(jī)理和育種研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 木薯；試管塊根誘導(dǎo)；蔗糖；植物生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號(hào) S533 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

木薯（Manihot esculenta Grantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）植物，耐旱抗貧瘠，廣泛種植于非洲、美洲和亞洲等100余個(gè)國家或地區(qū)，是世界三大薯類作物之一[1]。木薯用途廣泛，可食用、飼用和加工成各種工業(yè)產(chǎn)品，如淀粉、酒精等[2]。木薯主要在中國廣西、云南等熱帶亞熱帶地區(qū)廣泛種植，但產(chǎn)量供不應(yīng)求，平均產(chǎn)量較低。木薯是以地下貯藏塊根為主要經(jīng)濟(jì)收獲器官，所以研究木薯貯藏塊根發(fā)生發(fā)育具有重要意義。由于木薯塊根的發(fā)育和成熟需要6～10個(gè)月，且塊根生長在土壤中，研究觀察耗時(shí)長且不方便取材[3]；通過在離體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)試管塊根，是研究木薯塊根發(fā)生發(fā)育和形成機(jī)理的一個(gè)重要途徑。有關(guān)試管塊根或薯的誘導(dǎo)主要集中在馬鈴薯、山藥等作物，而木薯試管塊根誘導(dǎo)研究報(bào)道較少。Medina等[4]曾研究細(xì)胞分裂素、生長素等因素對(duì)木薯試管塊根形成的影響，并對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的試管塊根進(jìn)行了解剖學(xué)和形態(tài)學(xué)的比較研究。Fan等[5]也開展了木薯試管塊根誘導(dǎo)相關(guān)研究，在添加0.5 mg/L BA和0.5 mg/L NAA的條件下，60 g/L蔗糖濃度有利于木薯試管塊根誘導(dǎo)。另外，木薯試管塊根誘導(dǎo)的研究工作大多采用單因子分析法，這種方法效率較低，也不能探究各個(gè)因子的交互作用。本試驗(yàn)采用四因素三水平L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法研究蔗糖、萘乙酸（NAA）、多效唑（PP333）和茉莉酸甲酯（MeJA）4個(gè)影響因子對(duì)木薯試管塊根形成和植株形態(tài)的影響，探索誘導(dǎo)木薯試管塊根的較優(yōu)配方和不同因素對(duì)木薯植株生長形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

木薯品種‘華南205。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體材料 采用木薯品種‘華南205無菌組培苗單芽莖段，單芽莖段在MS+6-BA 0.01 mg/L+NAA 0.02 mg/L+蔗糖20.0 g/L的固體培養(yǎng)基中繼代增殖，繼代周期為45 d。

1.2.2 木薯試管塊根誘導(dǎo) 選擇蔗糖濃度、萘乙酸（NAA）、多效唑（PP333）和茉莉酸甲酯（MeJA）作為試驗(yàn)因子，每個(gè)因子設(shè)置3個(gè)水平，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，具體設(shè)計(jì)方法如表1所示，試驗(yàn)共有9個(gè)處理，其中處理1為對(duì)照（CK）。試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果挑選出較優(yōu)的處理進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。通過進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和淀粉粒觀察比較確定最優(yōu)配方組合。上述試驗(yàn)所使用的培養(yǎng)基均為固體培養(yǎng)基，由MS基本培養(yǎng)基和添加的6.3 g/L瓊脂、6-BA 0.02 mg/L以及表1中不同激素和蔗糖所組合而成。所有培養(yǎng)基均將pH值調(diào)至5.8～6.0后滅菌。

1.2.3 試管塊根淀粉顆粒觀察 取木薯組培苗根系，放入鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)50 ℃烘干，將烘干后的組培苗根系在研缽內(nèi)碾碎，取碾碎后的樣品0.5 g，以10～20倍蒸餾水均勻分散成懸濁液，加入3～4滴碘液染色。取1滴（約0.05 mL）懸濁液涂抹于載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕揉按以使顆粒分布均勻，在光學(xué)顯微鏡奧林巴斯BX-10下觀察拍照。

1.2.4 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度（27±1）℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種5瓶，每瓶接種6個(gè)無菌單芽莖段，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為：生根率、株高、最長根長、繁殖系數(shù)、平均根粗、最粗根粗、莖鮮重和干重、根鮮重和干重以及收獲指數(shù)。

生根率=生根組培苗數(shù)目/接種的組培苗數(shù)目×100%

株高和最長根長用直尺測(cè)量；根粗用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量根部最粗處；干重為材料在恒溫烘箱中50 ℃烘至恒重后稱量重量的平均值；收獲指數(shù)=根鮮重/全株鮮重；所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”的形式表示。

采用軟件SAS和Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理中植株形態(tài)的差異

經(jīng)過45 d離體的培養(yǎng)，生長在9種處理培養(yǎng)基的組培苗有顯著的形態(tài)差異（圖1）。從圖1和表2可以看出，CK生長正常，株高、最長根長、生根率和繁殖系數(shù)均是最高。與CK相比，其余8個(gè)處理對(duì)組培苗的生長存在不同程度的影響。在9個(gè)處理中，處理8的平均根粗和最粗根粗最大。從收獲指數(shù)來看，不同處理對(duì)組培苗莖和根生長影響差異較大，CK的收獲指數(shù)最低，收獲指數(shù)最高的發(fā)生在處理9組合。

2.2 各因子水平變化對(duì)試管塊根誘導(dǎo)和植株生長的影響

從極差分析結(jié)果（表3）可以看出，各因子水平變化均對(duì)木薯試管塊根誘導(dǎo)和植株生長產(chǎn)生明顯影響。從極差結(jié)果來看，PP333對(duì)平均根粗和最粗根粗的影響最大，其次是MeJA、蔗糖、NAA。使用最高水平的PP333濃度（0.1 mg/L）時(shí)，組培苗的平均根粗最大；說明高濃度PP333可以使木薯根部有效增粗。PP333和蔗糖對(duì)株高的影響相近，其次是NAA，影響最小的是MeJA。PP333或蔗糖添加濃度越高，組培苗越矮小。對(duì)生根率影響最大的是NAA，NAA濃度越高，組培苗生根率越低。

2.3 最優(yōu)配方組合的初步篩選

從表2可以看出，從生根率來看，處理5、7、9的生根率均不超過20%，顯著低于其它處理。處理3和處理6生根率僅50%左右，且它們的繁殖系數(shù)、最粗根粗和平均根粗較低。因此，本研究選擇處理2、4、8進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，處理1作為對(duì)照。

2.4 最優(yōu)配方組合的驗(yàn)證試驗(yàn)

表4表明，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果略有不同，但總體一致。從組培苗平均根粗和最粗根粗來看，處理4和處理8最高，顯著高于對(duì)照和處理2。

2.5 試管塊根淀粉顆粒觀察

淀粉粒觀察結(jié)果如圖2所示（淀粉粒呈紫色）。從圖2可以看出，4個(gè)處理的根系經(jīng)碘液染色在光學(xué)顯微鏡40倍物鏡下，1號(hào)處理只能觀察出極少量的淀粉粒；2號(hào)處理可觀察出大量淀粉粒，4號(hào)處理可觀察到少量大顆粒淀粉粒，8號(hào)處理的淀粉粒較小，很難觀察到淀粉粒，但在100倍物鏡下，可以觀察出有豐富的淀粉粒形成。

結(jié)合組培苗生長形態(tài)、根系形態(tài)和淀粉顆粒形成觀察結(jié)果來看，處理2內(nèi)有大量淀粉粒產(chǎn)生，但根系增粗不明顯；處理4的平均根粗有一定增加，但淀粉粒數(shù)量少；處理8的組培苗根系增粗明顯，且產(chǎn)生大量淀粉粒。因此，本研究認(rèn)為處理8為較優(yōu)的誘導(dǎo)試管塊根配方，具體配方為：1/2 MS+6-BA 0.02 mg/L+0.1 mg/L PP333+0.02 mg/L NAA+10 μmol/L MeJA+50 g/L蔗糖+6.3 g/L瓊脂。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法探討不同因素對(duì)木薯試管塊根誘導(dǎo)的影響，該方法已被前人廣泛應(yīng)用到馬鈴薯[6-7]、山藥[8-9]的試管結(jié)薯實(shí)驗(yàn)中，但還未見在木薯中的應(yīng)用報(bào)道。在以往的木薯試管塊根誘導(dǎo)中[4-5，10]，采用的多為單因子實(shí)驗(yàn)方法，這種方法需要根據(jù)每一個(gè)因子設(shè)置實(shí)驗(yàn)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不能考慮因子之間的交互作用。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，優(yōu)點(diǎn)是省時(shí)省工，缺點(diǎn)是不能具體考察某個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的具體影響，因?yàn)樵趹?yīng)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的實(shí)驗(yàn)體系中，所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆為幾個(gè)因素共同導(dǎo)致的。筆者通過本次正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，快速得到了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并且彌補(bǔ)了應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法誘導(dǎo)木薯試管塊根研究報(bào)道中的空白。

以往的研究，PP333被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)試管塊根或試管薯。豐鋒等[11]研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的PP333有利于山薯試管塊根的形成。肖關(guān)麗等[12]研究表明，高溫長日照抑制馬鈴薯試管薯形成，但高溫長日照條件下，馬鈴薯試管薯可以在添加PP333的培養(yǎng)基中形成，其機(jī)理是PP333可調(diào)節(jié)內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，逆轉(zhuǎn)高溫長日照對(duì)塊莖形成的抑制作用。張翠萍等[13]研究也發(fā)現(xiàn)PP333可以成功誘導(dǎo)彩色馬蹄蓮組培苗在試管中結(jié)球。本研究發(fā)現(xiàn)，PP333對(duì)根粗的增加起到明顯促進(jìn)作用，生長在添加高濃度PP333的培養(yǎng)基的組培苗根系顯著增粗，但植株生長受到明顯抑制；這與張勝珍等[14]和褚明宇等[15]研究結(jié)果十分相似。茉莉酸（JA）及其衍生物，在誘導(dǎo)山藥和馬鈴薯試管塊根中已被較多的應(yīng)用[8，16-17]。杜紅梅等[18]研究結(jié)果表明，MeJA可以提高香酥芋的子球鮮重、干重和干物質(zhì)含量，其推測(cè)機(jī)理可能是影響成球過程中貯藏物質(zhì)的積累。目前關(guān)于MeJA對(duì)木薯試管薯誘導(dǎo)影響的研究甚少，據(jù)了解，本試驗(yàn)是第一次使用MeJA作為誘導(dǎo)木薯試管薯的試驗(yàn)因子。通過極差分析，發(fā)現(xiàn)MeJA對(duì)木薯組培苗的平均根粗和收獲指數(shù)的影響較大，因此建議今后可開展關(guān)于MeJA對(duì)木薯塊根生長調(diào)控影響的研究。而本試驗(yàn)中還觀察到，有的淀粉粒較大，有的較小。推測(cè)可能是植物生長調(diào)節(jié)劑水平和種類的不同影響了組培苗根系的淀粉粒累積形態(tài)，具體原因有待進(jìn)一步探討研究。在姚遠(yuǎn)[10]的研究中，有單粒淀粉粒和復(fù)粒淀粉粒2種形態(tài)。

本試驗(yàn)在離體條件下成功誘導(dǎo)了木薯試管塊根發(fā)生。以試管塊根替代田間薯塊，將可能有利于離體條件下探討木薯塊根形成和發(fā)生發(fā)育機(jī)理，研究不同外源條件如植物生長調(diào)節(jié)劑等對(duì)木薯塊根形成的影響；也利于在木薯淀粉品質(zhì)改良育種中，可作為木薯育種輔助技術(shù)，并在離體條件下觀察淀粉粒形成和結(jié)構(gòu)變化。

木薯試管塊根誘導(dǎo)較優(yōu)的配方為1/2 MS+6-BA 0.02 mg/L+0.1 mg/L PP333+50 g/L蔗糖+0.02 mg/L NAA+10 μmol/L MeJA+6.3 g/L瓊脂。該配方誘導(dǎo)條件下，組培苗生根率達(dá)80%以上，組培苗形成的根系增粗明顯，根內(nèi)有較多淀粉顆粒形成。木薯試管塊根可為木薯塊根發(fā)生發(fā)育機(jī)理和育種研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] El-Sharkawy M A. Cassava biology and physiology[J]. Plant Molecular Biology， 2004， 56： 481-501.

[2] Balagopalan C. Cassava utilization in food， feed and industry[A]. In： Hillocks R J， Thresh J M， Bellotti A C（eds）. Cassava： biology， production and utilization[C]. CAB International， 2002： 301-318.

[3] 趙 超， 黃 潔.木薯栽培與育種[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2011： 17-21.

[4] Medina R D， Faloci M M， Gonzalez A M， et al. In vitro cultured primary roots derived from stem segments of cassava（Manihot esculenta）can behave like storage organs[J]. Annals of Botany， 2007， 99： 409-423.

[5] Fan M X， Liu Z C， Zhou L G， et al. Effects of plant growth regulators and saccharide on in vitro plant and tuberous root regeneration of cassava（Manihot esculenta Crantz）[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2011， 30： 11-19.

[6] 何 進(jìn). 植物生長物質(zhì)對(duì)馬鈴薯試管壯苗和試管塊根誘導(dǎo)的影響[D]. 雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011.

[7] 萬 林. 馬鈴薯試管塊根壯苗與誘導(dǎo)結(jié)薯培養(yǎng)組合篩選[D]. 雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012.

[8] 嚴(yán)華兵， 梁春秀， 楊麗濤， 等. 山薯試管零余子的誘導(dǎo)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2009， 30（11）： 1 641-1 645.

[9] Yan H B， Yang L T， Li Y R. Axillary shoot proliferation and tuberization of Dioscorea fordii Prain et Burk[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 2011， 104： 193-198.

[10] 姚 遠(yuǎn). 木薯組培苗貯藏根形成及淀粉[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2010.

[11] 豐 峰， 葉春海， 李映志， 等. 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、碳源和光周期對(duì)山薯試管塊根形成和生長發(fā)育的影響[J].植物生理學(xué)通訊， 2007， 43（6）： 1 045-1 049.

[12] 肖關(guān)麗， 龍?chǎng)┖纾?郭華春. 多效唑和溫光對(duì)馬鈴薯組培苗內(nèi)源激素及微型薯誘導(dǎo)的影響[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2011， 33（8）： 21-26.

[13] 張翠萍， 趙 健， 唐鳳鸞， 等. 多效唑、 矮壯素對(duì)彩色馬蹄蓮試管微型種球誘導(dǎo)的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2011， 42（11）： 1 320-1 323.

[14] 張勝珍， 客紹英， 馬作東， 等. 植物延緩劑PP333和B9對(duì)菘藍(lán)試管苗生長的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2009， 22（5）： 1 428-1 431.

[15] 褚明宇， 毛 娟， 陳佰鴻. PP333和CCC對(duì)葡萄試管苗生長的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2012， 21（11）： 151-157.

[16] Bazabakana R， Fauconnier M L， Diallo B， et al. Control of Dioscorea alata microtuber dormancy and germination by MeJA smonic acid[J]. Plant Growth Regulation， 1999， 27： 113-117.

[17] 陳大清， 王雪英， 李亞男. 水楊酸和茉莉酸甲酯對(duì)試管馬鈴薯形成的影響[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 24（1）： 74-78.

[18] 杜紅梅， 唐東梅， 黃丹楓. 茉莉酸甲酯對(duì)芋試管成球的影響[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版）， 2009， 27（5）： 480-484.