孫偉生　孫光明　劉勝輝　吳青松

摘 要 研究8個(gè)菠蘿品種的花粉特性以及離體條件下的花粉萌發(fā)。結(jié)果表明：不同菠蘿品種的花粉大小、花粉數(shù)量、花粉活力、花粉離體萌發(fā)率和花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度均存在明顯差異。金菠蘿花粉最大，金鉆花粉最??；單個(gè)花藥花粉量約3～18萬(wàn)粒，蜜寶花粉量最多，蘋果花粉量最少。用TTC法測(cè)定8個(gè)菠蘿品種的花粉活力為25.18%～56.84%，其中無(wú)刺卡因最高，黃金菠蘿最低。在離體培養(yǎng)條件下，不同菠蘿品種在9種培養(yǎng)基上的花粉萌發(fā)率均值和花粉管長(zhǎng)度均值變幅分別為53.31%～76.02%、43.27～518.28 μm，其中蜜寶、無(wú)刺卡因、甜蜜蜜、金菠蘿的花粉萌發(fā)率均值和花粉管長(zhǎng)度均值較高，珍珠、蘋果的花粉萌發(fā)率均值和花粉管長(zhǎng)度均值較低。配方為1%瓊脂+10%蔗糖+0.01%硼酸的培養(yǎng)基適于用作菠蘿花粉的離體萌發(fā)培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞 菠蘿；花粉特性；花粉離體萌發(fā)；花粉管長(zhǎng)度

中圖分類號(hào) S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The pollen characteristics and in vitro pollen germination of 8 pineapple cultivars were studied. Significant variations on pollen size， pollen quantity， pollen viability， in vitro pollen germination rate and the length of pollen tube were observed among the 8 pineapple cultivars. The results showed that the pollen of MD-2 was the largest and that of Jinzuan was the smallest. The amount of pollen grain per anther was estimated to be about 30～180 thousands from Pingguo to Mibao， while pollen viability revealed by TTC to be 25.18%～56.84% from Huangjin pineapple to Smooth Cayenne. The average pollen germination rate and length of pollen tube on 9 media in vitro of different pineapple cultivars ranged from 53.31%～76.02% and 43.27～518.28 μm respectively， in which both higher average values were held by Smooth Cayenne， Mibao， Tianmimi and MD-2 while lower average values held by Zhenzhu and Pingguo. Medium with a formula of 1% agar+10% sugar+0.01% boric acid was demonstrated to be suitable for pineapple pollen germination in vitro.

Key words Pineapple； Pollen characteristic； In vitro pollen germination； Pollen tube length

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.007

菠蘿[Ananas comosus（L.）Merrill]為鳳梨科（Bromeliaceae）鳳梨屬（Ananas Merr.）多年生草本果樹，是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物之一[1-2]。菠蘿原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū)的巴西，16世紀(jì)時(shí)期，我國(guó)開始引種栽培，至今已有400多年歷史[3]。目前，我國(guó)菠蘿的主栽品種仍為最初引種的皇后類巴厘種，與世界上其他菠蘿主產(chǎn)國(guó)相比，我國(guó)的菠蘿育種工作進(jìn)展緩慢[4]。菠蘿為自交不育果樹，生產(chǎn)上菠蘿果實(shí)一般很難有種子，常規(guī)雜交育種需要在不同類型的菠蘿品種間或同類型的不同品種間授粉，才能得到雜交種子[3，5]。花粉是種子植物的雄配子體，在有性繁殖中發(fā)揮著重要作用[6-8]。目前，對(duì)菠蘿花粉的特性方面的研究鮮有報(bào)道，國(guó)內(nèi)僅見菠蘿花粉保存方式的研究初報(bào)[5]，而對(duì)不同品種菠蘿花粉特性、花粉量的多少及花粉萌發(fā)率的高低并不十分清楚，在雜交授粉時(shí)存在一定盲目性。本研究以近年來(lái)引進(jìn)的7個(gè)菠蘿優(yōu)良品種和雜交常用的親本無(wú)刺卡因?yàn)椴牧希疾?個(gè)菠蘿品種花粉及其離體萌發(fā)特性，為菠蘿雜交授粉工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來(lái)自農(nóng)業(yè)部湛江菠蘿種質(zhì)資源圃。試驗(yàn)于2015年3月進(jìn)行，在各品種菠蘿盛花期，對(duì)相同品種的不同單株進(jìn)行混合取樣，從花序中上部位小花中采集完整花藥，裝入離心管，帶回實(shí)驗(yàn)室即用。供試菠蘿品種見表1。

1.2 方法

1.2.1 花粉形態(tài)觀測(cè) 每個(gè)品種各取10枚花藥裝入離心管，待花粉散開后混合取樣（其余指標(biāo)的花粉取樣方法除特殊說(shuō)明外，均與此相同）。在載玻片上滴1滴ddH2O，取少量花粉均勻撒上，蓋上蓋玻片，在倒置生物顯微鏡（OLYMPUS IX71）下觀察花粉形態(tài)。每個(gè)品種各取3個(gè)不同視野，每個(gè)視野隨機(jī)測(cè)量10個(gè)正?；ǚ鄣牧ｉL(zhǎng)和直徑，3次重復(fù)。

1.2.2 花粉數(shù)量測(cè)定 花粉數(shù)量的測(cè)定采用纖維素酶法[9]。取完整花藥10枚放入1.5 mL離心管中，25 ℃下烘干，使花粉完全散出，加入1%纖維素酶1 mL，處理24 h，充分振蕩后取1 μL滴于載玻片上，顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)，重復(fù)3次?；ǚ蹟?shù)量計(jì)算公式為：M=（m×1 000）/10，式中M為每枚花藥花粉數(shù)量（粒/花藥），m表示載玻片上總花粉粒數(shù)。

1.2.3 花粉活力測(cè)定 花粉活力測(cè)定采用TTC離體花粉染色法[10]。取1滴0.5 mol/mL的TTC溶液（pH=7）滴在載玻片上，取少量新鮮的花粉均勻撒在TTC溶液上，蓋上載玻片，置于37 ℃恒溫箱中，30 min后鏡檢，統(tǒng)計(jì)染色率，每個(gè)品種至少重復(fù)3次。

1.2.4 花粉萌發(fā)試驗(yàn) 按照表2配制花粉離體培養(yǎng)基，用玻璃棒取l滴液體培養(yǎng)基涂于載玻片上，使之厚薄均衡并接近圓形，待冷卻凝固后，用頭發(fā)絲蘸取少許菠蘿花粉，均勻涂抹在培養(yǎng)基表面，室溫（20 ℃）下暗培養(yǎng)12 h后鏡檢，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，花粉管長(zhǎng)度超過(guò)花粉粒直徑視為萌發(fā)，每個(gè)菠蘿品種每種培養(yǎng)基各重復(fù)5次。萌發(fā)率（%）=萌發(fā)花粉粒數(shù)/花粉總粒數(shù)×100。每個(gè)菠蘿品種每種培養(yǎng)基各選取10個(gè)以上花粉粒進(jìn)行花粉管長(zhǎng)度測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用EXCEL 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與作圖。SPSS 20.0進(jìn)行方差分析，采用General Linear Modal進(jìn)行雙因素主效應(yīng)檢驗(yàn)，多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 8個(gè)菠蘿品種的花粉形態(tài)

如圖1所示，8個(gè)菠蘿品種的花粉粒顏色均呈現(xiàn)黑褐色，正常成熟花粉粒的形狀大多接近圓球形。測(cè)定結(jié)果顯示，8個(gè)菠蘿品種的花粉大小存在差異（圖2），金菠蘿、黃金菠蘿、甜蜜蜜菠蘿的花粉粒顯著大于其它品種，三者在花粉粒長(zhǎng)度和直徑上無(wú)顯著差異，以金菠蘿的花粉粒最大，花粉粒長(zhǎng)度和直徑分別為44.23和38.98 μm。金鉆菠蘿的花粉粒最小，其花粉粒長(zhǎng)度為32.86 μm，顯著小于其它菠蘿品種，花粉粒直徑也較低，為28.88 μm。其余菠蘿品種按花粉粒大小降序排列為：蘋果菠蘿>珍珠菠蘿>無(wú)刺卡因>蜜寶菠蘿。經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢測(cè)，8個(gè)菠蘿品種的花粉粒長(zhǎng)度和直徑數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布。

2.2 8個(gè)菠蘿品種的花粉數(shù)量

8個(gè)菠蘿品種的花粉數(shù)量（平均單個(gè)花藥的花粉粒數(shù)）存在較大差異（圖3），變幅為34 200～182 300粒，經(jīng)Shapiro-Wilk檢測(cè)，8個(gè)菠蘿品種的花粉數(shù)量不符合正態(tài)分布。其中蜜寶的花粉數(shù)量最多，約18.23萬(wàn)，顯著高于其它7個(gè)品種；蘋果、珍珠、金鉆的花粉數(shù)量較為接近，為3～4萬(wàn)，顯著低于其它品種；其余品種的花粉量介于7～10萬(wàn)，占品種數(shù)的50%。

2.3 8個(gè)菠蘿品種的花粉活力

由圖4可知，經(jīng)TTC法測(cè)定的8個(gè)菠蘿品種的花粉活力存在差異，變幅為25.18%～56.84%，經(jīng)Shapiro-Wilk檢測(cè)，8個(gè)菠蘿品種的花粉活力數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。花粉活力較高的品種有無(wú)刺卡因、蜜寶和金鉆，其中無(wú)刺卡因的花粉活力最高，為56.84%，但三者間差異不顯著；花粉活力較低的品種有黃金菠蘿和珍珠，以黃金菠蘿的花粉活力最低，為25.18%；甜蜜蜜和金菠蘿的花粉活力相當(dāng)，約42%，低于金鉆，高于蘋果。

2.4 8個(gè)菠蘿品種的花粉離體萌發(fā)特性

方差分析結(jié)果表明，品種、培養(yǎng)基以及二者的交互作用對(duì)菠蘿花粉的萌發(fā)率和花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度均有顯著影響（表3）。結(jié)合表4分析可知，不同菠蘿品種在不同培養(yǎng)基上的花粉萌發(fā)率存在明顯差異。8個(gè)菠蘿品種的花粉離體萌發(fā)率均在50%以上，其中花粉萌發(fā)率均值最高為蜜寶（76.02%），無(wú)刺卡因（72.70%）次之，甜蜜蜜（68.31%）和金菠蘿（68.11%）的花粉萌發(fā)率均值相當(dāng)；金鉆、黃金菠蘿、蘋果的花粉萌發(fā)率均值相對(duì)較低，但均大于60%；花粉萌發(fā)率均值最低為珍珠（53.31%）。不同培養(yǎng)基的花粉萌發(fā)率極差較大的菠蘿品種有：甜蜜蜜（46.50%）、蘋果（39.77%）、金菠蘿（34.9%）、蜜寶（30.28%），極差最小的菠蘿品種是無(wú)刺卡因（7.5%）。在9種參試培養(yǎng)基中，5號(hào)培養(yǎng)基的花粉萌發(fā)率均值最高，8號(hào)培養(yǎng)基次之，4號(hào)培養(yǎng)基的花粉萌發(fā)率均值最低，其余培養(yǎng)基間的花粉萌發(fā)率均值差異不顯著。各菠蘿品種的花粉萌發(fā)率均在50%以上的培養(yǎng)基有6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)，其中6號(hào)培養(yǎng)基的花粉萌發(fā)率均值僅次于5號(hào)、8號(hào)， 除珍珠的花粉萌發(fā)率相對(duì)較低外，其余7個(gè)菠蘿品種在6號(hào)培養(yǎng)基上的花粉萌發(fā)率無(wú)顯著差異。

如表5所示，不同菠蘿品種在不同培養(yǎng)基上的花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度也有差異。8個(gè)菠蘿品種中，無(wú)刺卡因、蜜寶、甜蜜蜜、金菠蘿的花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度均值均在400 μm以上，顯著高于其他品種。其余4個(gè)菠蘿品種的花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度均值排序?yàn)椋航疸@>黃金菠蘿>蘋果>珍珠，品種間差異顯著。9種培養(yǎng)基中，菠蘿花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度均值最大為5號(hào)培養(yǎng)基，其次為1號(hào)培養(yǎng)基；9號(hào)、3號(hào)、8號(hào)培養(yǎng)基中的菠蘿花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度均值較小，其中均值最小的是9號(hào)培養(yǎng)基，除甜蜜蜜外，其余7個(gè)菠蘿品種在9號(hào)培養(yǎng)基中的花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度均小于100 μm。

3 討論與結(jié)論

花粉是種子植物的雄配子體，對(duì)授粉受精和果實(shí)形成有重要影響。植物花粉量及其生活力是開花植物生物學(xué)特性研究中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，果樹花粉量的多少和花粉萌發(fā)率的高低直接影響其授粉、受精乃至坐果[8]。菠蘿雜交授粉中，授粉品種的花粉數(shù)量、活力等直接影響著授粉結(jié)果和效率。本研究結(jié)果表明，8個(gè)菠蘿品種間單花藥花粉量差異較大，蜜寶的花粉量最多，高達(dá)18萬(wàn)粒；蘋果、珍珠、金鉆菠蘿的花粉數(shù)量較低，約3～4萬(wàn)粒；黃金菠蘿、甜蜜蜜、金菠蘿和無(wú)刺卡因的花粉量介于7～10萬(wàn)粒。各菠蘿品種的花粉TTC活力、花粉離體萌發(fā)率和花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度也存在明顯差異，無(wú)刺卡因、蜜寶、金鉆的花粉TTC活力較高，黃金菠蘿和珍珠的花粉TTC活力較低；蜜寶的花粉離體萌發(fā)率均值最高，無(wú)刺卡因、甜蜜蜜、金菠蘿的花粉萌發(fā)率均值也較高，珍珠的花粉萌發(fā)率均值最低；無(wú)刺卡因、蜜寶、甜蜜蜜、金菠蘿的花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度均值較大，珍珠的花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度均值最小。筆者在多年菠蘿雜交授粉實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，用珍珠菠蘿的花粉給其他類型菠蘿品種授粉后，得籽率較低，這一現(xiàn)象可能與該品種花粉數(shù)量少、花粉活力較低有關(guān)，且因其花期短、苞片覆蓋緊、微開放等開花性狀導(dǎo)致花粉采集較為困難，因此，在雜交育種中，該品種不宜用作父本。筆者還發(fā)現(xiàn)，以其他類型菠蘿品種的花粉授粉給珍珠菠蘿，同樣得籽率很低，這可能與珍珠菠蘿的花器官構(gòu)造有關(guān)，需進(jìn)一步研究證明。蘋果菠蘿與珍珠菠蘿類似，用其花粉給其他類型菠蘿品種授粉后的得籽率較低，由于蘋果菠蘿也存在花粉數(shù)量少、花粉活力低的現(xiàn)象，因此也不宜用作父本。根據(jù)本文的研究結(jié)果，蜜寶菠蘿的花粉量大，花粉活力高，是優(yōu)良的授粉親本，這與筆者用蜜寶菠蘿作雜交父本得籽率較高的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)相符。此外，無(wú)刺卡因、甜蜜蜜、金菠蘿等菠蘿品種的花粉量較大，花粉活力相對(duì)較高，也適宜用作雜交授粉的父本。

本研究中8個(gè)菠蘿品種的花粉TTC活力變幅為25.18%～56.84%，而花粉離體萌發(fā)率變幅為53.31%～76.02%，可知，8個(gè)菠蘿品種的花粉離體萌發(fā)率數(shù)據(jù)普遍大于其花粉TTC活力測(cè)定數(shù)據(jù)，這與姜雪婷等[11]在梨品種的花粉活力研究中得出的結(jié)果類似，究其原因，可能是用TTC法測(cè)定菠蘿花粉活力時(shí)存在著色不良，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低，不能準(zhǔn)確反映菠蘿花粉的實(shí)際活力有關(guān)，筆者認(rèn)為在考察菠蘿花粉活力時(shí)應(yīng)以花粉離體萌發(fā)情況為準(zhǔn)。

根據(jù)本研究中的花粉離體萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果，5號(hào)培養(yǎng)基中菠蘿花粉萌發(fā)率及花粉管萌發(fā)長(zhǎng)度均值均為最高，表明當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為10%、硼酸濃度為0.01%時(shí)，較利于菠蘿花粉的離體萌發(fā)，這與前人在桃[12]、李[13]、菠蘿蜜[14]的花粉離體萌發(fā)研究中篩選出的蔗糖、硼酸濃度相一致，5號(hào)培養(yǎng)基適于用作菠蘿的花粉離體培養(yǎng)基。

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