付莉莉 韓冰瑩 譚德冠 孫雪飄 張家明

摘要：【目的】克隆木薯葡聚糖水合雙激酶（MeGWD3）基因并構(gòu)建其植物表達(dá)載體，為開展木薯MeGWD3基因調(diào)控及功能研究提供參考?！痉椒ā坎捎肦T-PCR從木薯華南124（SC124）中克隆MeGWD3基因，對其進(jìn)行序列分析，并將其連接至改造的pCAMBIA2300載體，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-MeGWD3?！窘Y(jié)果】MeGWD3基因全長3522 bp，編碼1173個(gè)氨基酸。經(jīng)序列比對，發(fā)現(xiàn)MeGWD3基因序列與木薯Phytozome數(shù)據(jù)庫中公布的GWD基因（cassava4.1_000497m）只存在2個(gè)堿基差異，同源性高達(dá)99.94%；與NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的木薯GWD基因（JN618460）同源性高達(dá)99.00%，與蓖麻GWD基因（XM_002518566）同源性達(dá)86.00%；成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-MeGWD3?！窘Y(jié)論】成功構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300可用于MeGWD3基因功能及木薯淀粉代謝研究。

關(guān)鍵詞： 木薯；葡聚糖水合雙激酶；克??；植物表達(dá)載體

中圖分類號： S533 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1057-07

0 引言

【研究意義】植物淀粉是食品和工業(yè)應(yīng)用中重要的原材料之一。木薯（Manihot esculenta）塊根淀粉含量極高，被譽(yù)為淀粉之王。淀粉磷酸化是淀粉代謝的一個(gè)重要機(jī)制，由一系列酶促反應(yīng)調(diào)控。葡聚糖水合雙激酶（Glucan water dikinase，GWD）是淀粉磷酸化作用酶，在淀粉代謝中起關(guān)鍵作用。此外，近年來的研究結(jié)果表明，GWD基因還與抗逆和光周期等密切相關(guān)（Reimann et al.，2002；Yano et al.，2005；Hejazi et al.，2014）。因此，進(jìn)行木薯GWD基因克隆及其表達(dá)載體構(gòu)建對開展木薯MeGWD3基因調(diào)控及功能研究具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】Lorberth等（1998）最早發(fā)現(xiàn)馬鈴薯淀粉顆粒中存在一種R1蛋白，其含量與淀粉磷酸化程度高度相關(guān)，該蛋白被確認(rèn)為GWD。Yu等（2001）發(fā)現(xiàn)GWD基因突變會導(dǎo)致淀粉磷酸化受阻，從而使淀粉降解困難。Nielsen等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中過量表達(dá)GWD，導(dǎo)致糖原磷酸化程度提高了6倍。Theerawitaya等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，水稻GWD基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控與鹽脅迫相關(guān)，其機(jī)制是通過磷酸化淀粉，加快淀粉在凍害前被淀粉酶降解為可溶性糖的速度。Hejazi等（2014）根據(jù)擬南芥野生型和GWD突變體對不同光周期反應(yīng)，證明GWD基因與光周期密切相關(guān)，在淀粉代謝過程起重要作用。Skeffington等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)GWD基因未加速擬南芥葉片淀粉的降解，直到其表達(dá)水平下降70%后，淀粉降解和合成均被抑制。目前，關(guān)于木薯淀粉的研究報(bào)道主要集中在淀粉結(jié)構(gòu)與性質(zhì)方面（趙奕玲等，2007；古碧等，2009；安飛飛等，2015），被研究的淀粉代謝相關(guān)基因主要有SBE、AGPase、GBSS等（許娟等，2012；郭運(yùn)玲等，2013；陳會鮮，2014；郭雅靜等，2014；劉平平等，2015）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)木薯GWD基因的研究未見報(bào)道，其生物學(xué)功能也尚未清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以木薯為材料，利用RT-PCR克隆MeGWD3基因片段并進(jìn)行序列分析，將其連接至改造的pCAMBIA2300載體，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-MeGWD3，為進(jìn)一步開展MeGWD3調(diào)控及基因功能研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為木薯品種華南124（SC124），種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所試驗(yàn)田。大腸桿菌DH5α購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；改造的pCAMBIA2300載體由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室保存提供；pMD19-T載體、T4連接酶、DNaseI、DNA Polymerase購自寶生物工程（大連）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和限制性內(nèi)切酶購自加拿大Fermentas公司；Plant RNA Reagent試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒和DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)木薯Phytozome數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/cassava）中公布的GWD基因（cassava4.1_000497m）序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。為了方便后續(xù)植物表達(dá)載體的構(gòu)建，在正向引物FGWDF4（5'-GGGGTACCATGGATTCTCTGCGTGTATTG-3'）插入KpnⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線處），反向引物FG

WDR4（FGWDR4：5'-CGGGATCCCTATGGTTGTGG

GCGTGTC-3'）插入BamHⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線處），并加上保護(hù)堿基。這2個(gè)酶切位點(diǎn)是pCAMBIA2300載體的多克隆位點(diǎn)，但在MeGWD3基因序列上不存在。

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA合成 取新鮮的木薯葉片1.0 g，液氮研磨，根據(jù)Plant RNA Reagent試劑盒說明提取總RNA，生物分析儀Agilent 2100測定RNA濃度為395 ng/μL，-80 ℃保存。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。

1. 2. 3 基因克隆及序列分析 以木薯葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（50.0 μL）：cDNA模板1.0 μL，10×LA Taq Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，5 U/μL LA Taq酶0.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL，ddH2O 37.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 3.5 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，25 ℃保存。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段與TA克隆載體pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和PCR驗(yàn)證后，選擇陽性克隆送至深圳華大基因科技有限公司測序。利用NCBI-BLAST對獲得的目的片段進(jìn)行同源性比對，并利用在線軟件（http：//www.bio-soft.net/sms/index.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸序列分析，最后利用MEGA 6.0構(gòu)建MeGWD3基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 4 植物表達(dá)載體構(gòu)建及陽性克隆篩選 將重組質(zhì)粒pMD19-T-MeGWD3和pCAMBIA2300載體分別用KpnⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切。酶切體系（20.0 μL）：質(zhì)粒10.0 μL，10×Fast Digest Buffer 2.0 μL，KpnⅠ和BamHⅠ各0.5 μL，ddH2O 7.0 μL，于37 ℃反應(yīng)3～4 h。酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，回收目的條帶，將其與pCAMBIA2300載體用T4連接酶于16 ℃連接過夜，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-MeGWD3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過藍(lán)白斑篩選陽性克隆并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、雙酶切及測序驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2. 1 木薯總RNA提取結(jié)果

木薯葉片總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）表明，RNA完整性較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 MeGWD3基因克隆結(jié)果

將提取的木薯葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條約3500 bp的條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。將目的片段切膠回收，回收產(chǎn)物與TA克隆載體pMD19-T連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR（圖3）和雙酶切（圖4）驗(yàn)證，結(jié)果表明已成功克隆獲得MeGWD3基因。

2. 3 MeGWD3基因序列分析結(jié)果

MeGWD3基因測序結(jié)果如圖5所示，該基因含有一個(gè)完整的開放閱讀框，長度為3522 bp，編碼1173個(gè)氨基酸。BLAST結(jié)果表明，MeGWD3與NCBI中公布的木薯GWD基因（JN618460）同源性高達(dá)99.00%，與蓖麻GWD基因（XM_002518566）同源性達(dá)86.00%，與木薯Phytozome數(shù)據(jù)庫中公布的GWD基因（cassava 4.1_000497m）只存在2個(gè)堿基差異，同源性高達(dá)99.94%，進(jìn)一步證明已成功克隆MeGWD3基因。

為了解MeGWD3與其他植物GWD基因的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 6.0構(gòu)建不同植物GWD基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖6可知，MeGWD3與蓖麻（Ricinus communis）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）、楊樹（Populus euphratica）的GWD基因親緣關(guān)系較近，而與油菜（Brassica napus）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana）的GWD基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2. 3 植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-MeGWD3構(gòu)建

用KpnⅠ和BamHⅠ分別雙酶切pCAMBIA2300載體和重組質(zhì)粒pMD19-T-MeGWD3后，將MeGWD3基因連接至pCAMBIA2300載體上（圖7），并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR（圖8）、雙酶切（圖9）及測序驗(yàn)證，結(jié)果表明已成功構(gòu)建獲得植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-MeGWD3。

3 討論

GWD在淀粉代謝中起催化淀粉磷酸化的作用（謝淑蓉和浦躍武，2005；孫瀟和包勁松，2014）。GWD基因最早是在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)，其蛋白質(zhì)含量與淀粉磷酸化程度高度相關(guān)（Lorberth et al.， 1998）。隨后，GWD基因從擬南芥（Kaplan and Guy， 2005）、小麥（Ral et al.， 2012）和水稻（Boriboonkaset et al.， 2013）等不同物種中克隆獲得并對其功能開展了研究。序列分析結(jié)果表明，擬南芥和馬鈴薯的GWD基因序列具有較高的保守性，氨基酸序列相似性達(dá)79.00%（Hejazi et al.， 2012）。本研究采用RT-PCR從木薯SC124中成功克隆MeGWD3基因，長度為3522 bp，編碼1173個(gè)氨基酸，其序列比對分析結(jié)果表明，MeGWD3基因與木薯Phytozome數(shù)據(jù)庫中參考基因的序列同源性高達(dá)99.94%，二者間僅存在2個(gè)堿基差異，可能是木薯品種間的差異造成的。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果表明，MeGWD3與蓖麻GWD基因（XM_002518566）的同源性最高，達(dá)86.00%。

隨著RNAi、超表達(dá)等轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，研究者對GWD基因的功能有了更進(jìn)一步的認(rèn)識。如利用反義技術(shù)可抑制馬鈴薯GWD基因表達(dá)，而導(dǎo)致淀粉結(jié)合磷酸鹽減少90%（Lorberth et al.， 1998）；過量表達(dá)GWD基因可使糖原磷酸化程度顯著增加（Nielsen et al.， 2002）。通過RNAi技術(shù)下調(diào)GWD基因的表達(dá)可增加小麥籽粒生物量（Ral et al.， 2012）。由此可見，構(gòu)建目的基因表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究目的基因的功能，已成為常規(guī)的分子生物學(xué)方法。本研究利用雙酶切法將MeGWD3基因片段與pCAMBIA2300載體連接，成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2300- MeGWD3，可為下一步通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究MeGWD3基因功能打下基礎(chǔ)。

此外，研究目的基因在多種脅迫條件下的表達(dá)差異也是常見的基因功能分析手段之一。如在鹽和凍害脅迫下GWD基因的表達(dá)量均增加（Kaplan and Guy，2005；Boriboonkaset et al.，2013），據(jù)此推測GWD基因具有耐鹽和抗凍害的功能。但本研究尚未涉及MeGWD3基因表達(dá)的分析，因此，MeGWD3基因?qū)Ω鞣N脅迫條件的響應(yīng)有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

根據(jù)木薯數(shù)據(jù)庫已知的GWD基因序列，采用RT-PCR從木薯SC124中成功克隆獲得MeGWD3基因，其cDNA全長3522 bp，編碼1173個(gè)氨基酸，將其與pCAMBIA2300載體連接，可成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-MeGWD3，為進(jìn)一步研究該基因的功能及木薯淀粉代謝打下基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）