趙喜亭 朱玉婷 田瑩 王昭陽(yáng) 周穎媛 范子建 蔣麗微 李明軍

摘要：【目的】探究番茄不孕病毒（TAV）脫除對(duì)懷白菊葉綠素含量和氮代謝水平的影響，為懷白菊脫毒苗的大田推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳郧捌讷@得的TAV脫除懷白菊試管苗為試材，以未經(jīng)脫除TAV的試管苗為對(duì)照（CK），對(duì)兩者進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中葉片葉綠素含量及氮代謝的相關(guān)生理指標(biāo)?！窘Y(jié)果】繼代培養(yǎng)過(guò)程中，CK與TAV脫除懷白菊試管苗葉片的葉綠素α和葉綠素b含量隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而升高，兩者均以繼代第22 d時(shí)的增幅最大，分別為5.24%和41.69%。與CK相比，TAV脫除提高了相同培養(yǎng)天數(shù)時(shí)葉片的葉綠素a、葉綠素b含量，且差異達(dá)顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01）水平。懷白菊脫除TAV病毒后，其硝酸還原酶（NR）活力、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量在繼代培養(yǎng)過(guò)程中均顯著高于CK，三者最大增幅分別為27.99%（繼代22 d）、28.10%（繼代22 d）和5.89%（繼代38 d）?！窘Y(jié)論】TAV脫除能有效提高懷白菊的葉綠素含量及氮代謝水平，利于其生長(zhǎng)發(fā)育。

關(guān)鍵詞： 懷白菊；番茄不孕病毒；脫毒；葉綠素含量；氮代謝

中圖分類號(hào)： S567.239 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）07-1095-05

0 引言

【研究意義】懷白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat. Huaibai）為菊科（Asteraceae）菊屬（Chrysanthemum L.）植物，特指產(chǎn)于古懷慶府（今河南省溫縣一帶）的藥菊，因其具有較高的藥用價(jià)值而備受青睞。懷白菊主要靠扦插、分株等營(yíng)養(yǎng)方式進(jìn)行繁殖，長(zhǎng)期的營(yíng)養(yǎng)繁殖使病毒危害嚴(yán)重，引起植株不同程度地花葉、壞死、萎縮等，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。經(jīng)過(guò)本課題組前期對(duì)河南省焦作市一帶染病懷白菊進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，其主要感染病毒為番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV），并探明了TAV的結(jié)構(gòu)和全核苷酸序列（Zhao et al.，2015）。TAV是一種RNA病毒，以非持久性的方式由多種蚜蟲傳播或汁液接種傳播，在懷白菊上普遍發(fā)生。因此，開展懷白菊TAV病毒脫除及脫除后對(duì)其生理生化影響的研究，可為懷白菊脫毒苗的大田推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】針對(duì)病毒危害問(wèn)題，各種植物脫毒技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生并取得了較好的效果（Wang and Valkonen，2009；欒愛萍，2012；Budiarto，2013）。因懷白菊作為道地藥材的特殊性，為保持藥材的綠色環(huán)保，莖尖結(jié)合熱處理可作為其脫除病毒的首選方法。本研究室前期已通過(guò)莖尖結(jié)合熱處理脫除了懷白菊的TAV病毒。大量研究表明，植物脫除病毒后，其生理生化特性均會(huì)有一定程度的提高，如安徽藥菊（薛建平等，2004）、香石竹（王麗花等，2012）脫毒后其葉綠素含量提高，光合速率在一定程度上也隨之提高。氮代謝是植物體內(nèi)一個(gè)重要的生理過(guò)程，直接影響著植物的產(chǎn)量和品質(zhì)（張智猛等，2006），甘薯、蘋果脫除病毒后，光合能力提高，氮代謝活躍，葉片游離脯氨酸、可溶性蛋白含量增加，硝酸還原酶（NR）活性明顯增強(qiáng)（陳選陽(yáng)等，2001；吳玉霞，2008；周全盧等，2014）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組結(jié)合懷白菊生產(chǎn)實(shí)際從2011年開始致力于病毒調(diào)查、鑒定、脫除及病毒脫除后的活性氧代謝與生理生化變化、脫毒苗的大田適應(yīng)性等方面的研究，明確了TAV是其感染的主要病毒（Zhao et al.，2015），TAV脫除降低了其活性氧代謝水平，增強(qiáng)了其抗氧化能力（趙喜亭等，2015）。但TAV脫除對(duì)懷白菊葉片光合作用和氮代謝水平的影響尚不清楚，需進(jìn)一步探討?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以前期獲得的TAV脫除懷白菊試管苗為試材，通過(guò)對(duì)其光合和氮代謝相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，研究繼代培養(yǎng)過(guò)程中TAV脫除后懷白菊葉片葉綠素a和葉綠素b含量、NR活力、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量的變化，旨在探索TAV脫除對(duì)懷白菊光合和氮代謝水平的影響，為懷白菊脫毒苗的大田推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料原始植株具有感染病毒的特征，采集于河南科霖達(dá)菊珍飲品股份有限公司的懷菊花種植基地，由河南省溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所王天亮高級(jí)農(nóng)藝師進(jìn)行基原鑒定為懷白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat. Huaibai），之后在綠色藥材生物技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）建立無(wú)菌試管苗，采用莖尖結(jié)合熱處理的方法獲得莖尖苗，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)得到脫除TAV的懷白菊試管苗（繼代22 d）。

1. 2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在河南師范大學(xué)綠色藥材生物技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將前期獲得的脫除TAV的懷白菊試管苗（Virus-free）及其對(duì)照苗（未經(jīng)脫除TAV的試管苗，CK）在超凈工作臺(tái)上切成帶有腋芽的莖段（長(zhǎng)約1 cm），接種于1/2 MS+NAA 0.01 mg/L生根培養(yǎng)基中，放入溫度為25 ℃、光強(qiáng)3000 lx、光照12 h的培養(yǎng)室中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，待培養(yǎng)至第22 d，挑選長(zhǎng)勢(shì)基本一致的組培苗，取頂端完全展開第二、三片葉片測(cè)定其葉綠素含量及氮代謝相關(guān)指標(biāo)，每隔8 d測(cè)定1次，即第22、30、38、46和54 d進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定3個(gè)樣本，共測(cè)定5次。

1. 3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

葉綠素a和葉綠素b含量采用丙酮乙醇混合液比色法測(cè)定（李合生，2000），以丙酮乙醇混合液（體積比為1∶1）為提取液，按葉片∶丙酮（g∶mL）=1∶150比例在黑暗下提取24 h，于645和663 nm下進(jìn)行比色，按下列公式計(jì)算葉綠素含量：

式中，Ca、Cb分別為葉綠素a、葉綠素b的濃度，A663和A645分別為葉綠素溶液在663和645 nm處的吸光值。

葉綠素含量（mg/g）=葉綠素濃度×提取液總體積×稀釋倍數(shù)/樣品鮮重

NR活力采用離體磺胺比色法測(cè)定（李合生，2000）；游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測(cè)定（李合生，2000）；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮蘭染色法測(cè)定（趙喜亭等，2011）。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 13.0進(jìn)行整理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 TAV脫除對(duì)懷白菊試管苗葉綠素含量的影響

如圖1所示，在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，懷白菊試管苗葉片中葉綠素a和葉綠素b含量變化趨勢(shì)相同，均隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而升高，且TAV脫除未改變?nèi)~片葉綠素含量的變化趨勢(shì)。與CK相比，相同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)下TAV脫除試管苗葉片的葉綠素a和葉綠素b含量顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01，下同）升高，兩者均以繼代培養(yǎng)第22 d時(shí)的增幅最大，分別為5.24%和41.69%，與CK差異極顯著。

2. 2 TAV脫除對(duì)懷白菊試管苗氮代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

2. 2. 1 NR活力 由圖2可看出，繼代培養(yǎng)過(guò)程中，CK與TAV脫除試管苗葉片NR活力均隨培養(yǎng)天數(shù)的增加呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，培養(yǎng)至第46 d時(shí)達(dá)最大值。TAV脫除試管苗葉片NR活力除在第46 d時(shí)顯著高于CK外，其他對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的NR活力均極顯著高于CK，其中在繼代22 d時(shí)的增幅最大，為27.99%。

2. 2. 2 游離脯氨酸含量 由圖3可看出，繼代培養(yǎng)過(guò)程中， CK與TAV脫除試管苗葉片的游離脯氨酸含量均隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而升高。與CK相比，TAV脫除提高了相同培養(yǎng)天數(shù)時(shí)葉片的游離脯氨酸含量， 繼代培養(yǎng)22、46和54 d時(shí)游離脯氨酸含量顯著提高，最大增幅為28.10%（繼代22 d）。

2. 2. 3 可溶性蛋白含量 由圖4可看出，繼代培養(yǎng)過(guò)程中，CK與TAV脫除試管苗葉片的可溶性蛋白含量均隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而升高。與CK相比，TAV脫除顯著提高了與相同培養(yǎng)天數(shù)時(shí)葉片的可溶性蛋白含量，最大增幅為5.89%（繼代38 d）。

3 討論

葉綠素是與光合作用相關(guān)的重要色素分子，參與光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，在光合作用中扮演重要的角色，其含量的高低在一定程度上可反映植物的光合能力（張國(guó)民等，2000）。葉綠素a是光合作用的中心色素分子，葉綠素b是聚光色素。植物感染病毒后，其葉綠體數(shù)量及結(jié)構(gòu)會(huì)遭到不同程度破壞，導(dǎo)致葉綠素含量降低，進(jìn)而影響植物光合作用。植物脫除病毒能夠降低病毒對(duì)其葉綠體數(shù)量及結(jié)構(gòu)的傷害，使葉綠素含量有不同程度的提高，如薛建平等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，安徽藥菊脫除病毒后葉綠素含量及凈光合速率均有所提高；葛曉霞等（2006）研究表明，脫毒駿棗樹葉片葉綠素含量均高于對(duì)照，光合速率總體明顯高于普通駿棗樹，尤其在上午8：00～12：00時(shí)平均增高10.7%～

76.6%；王麗花等（2012）研究表明，香石竹經(jīng)過(guò)脫毒處理后其葉綠素a和葉綠素b含量均顯著高于非脫毒苗。本研究結(jié)果表明，與未進(jìn)行脫毒的試管苗相比，TAV脫除提高了懷白菊繼代培養(yǎng)過(guò)程中相同培養(yǎng)天數(shù)時(shí)葉片的葉綠素a和葉綠素b含量，且差異達(dá)顯著水平，其中葉綠素b含量最大增幅達(dá)41.69%（繼代22 d）。表明TAV脫除能夠使懷白菊維持較高的葉綠素水平，在相同光照條件下，能夠吸收更多光能，有利于提高懷白菊光合能力。

氮代謝是植物體內(nèi)一個(gè)重要的生理過(guò)程，包括無(wú)機(jī)氮的還原、同化及有機(jī)含氮化合物轉(zhuǎn)化、合成等過(guò)程（Miller and Cramer，2004）。與其相關(guān)的生理指標(biāo)主要有NR活性、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量等，這些指標(biāo)對(duì)植物生長(zhǎng)均具有重要作用（陳永明等，2014；孫菲菲等，2014；唐秀梅等，2014）。NR可催化植物體內(nèi)硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，是植物氮同化過(guò)程中關(guān)鍵的限速酶，葉片中NR活性的高低控制著整個(gè)同化過(guò)程，其強(qiáng)弱在一定程度上反映了光合、呼吸及蛋白質(zhì)合成和氮代謝活性（張智猛等，2006；林麗琳等，2015）。脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一，并以游離狀態(tài)廣泛存在于植物體中，是逆境下植物體內(nèi)氮和能量的貯存庫(kù)，對(duì)植物體內(nèi)的酶和膜結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用（陸彬彬，2004）。大多數(shù)可溶性蛋白是參加各種代謝的酶類，其含量是植物總體代謝的一個(gè)重要指標(biāo)（宋新穎等，2014）。研究表明，植物脫除病毒能夠降低病毒對(duì)其自身生理活動(dòng)的影響，從而提高植物吸收和利用氮的能力，減少硝酸鹽的積累，促進(jìn)氨基酸的合成，進(jìn)而利于植株的生長(zhǎng)，如陳選陽(yáng)等（2001）研究表明，甘薯脫除病毒后其氮代謝活躍，葉片游離脯氨酸含量增加，硝酸還原酶活性明顯增強(qiáng)；吳玉霞（2008）研究發(fā)現(xiàn)，在試管苗生長(zhǎng)后期，華紅、粉紅佳人和煙富一號(hào)3個(gè)蘋果品種脫毒苗葉片中的脯氨酸含量、硝酸還原酶活性和可溶性蛋白含量均顯著高于普通苗，且差異達(dá)極顯著水平。本研究結(jié)果與上述前人研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，懷白菊脫除TAV病毒后，其NR活力、游離脯氨酸含量、可溶性蛋白含量在繼代培養(yǎng)過(guò)程中均顯著高于非脫毒苗，三者增加最大幅度值分別為27.99%（繼代22 d）、28.10%（繼代22 d）和5.89%（繼代38 d）。脫除TAV的懷白菊硝酸還原酶活性提高，能夠減少硝酸鹽在葉片內(nèi)的積累，降低可溶性氮化合物的積聚，從而促進(jìn)部分氨基酸與蛋白質(zhì)的合成。說(shuō)明TAV脫除使懷白菊在繼代培養(yǎng)過(guò)程中維持著較高水平的氮代謝。

植物氮代謝與葉綠素含量及光合能力密切相關(guān)。光合作用是作物生長(zhǎng)最基本的生理過(guò)程之一，其生成的同化力和代謝中間產(chǎn)物被氮代謝所利用。氮是葉綠素、蛋白質(zhì)和酶的重要組成物質(zhì)，通過(guò)對(duì)植物葉綠素、光合速率、暗反應(yīng)的主要酶以及光呼吸等的影響直接或間接影響植物光合作用（尹麗等，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)TAV的脫除顯著增加了相同培養(yǎng)天數(shù)時(shí)懷白菊葉片的葉綠素a和葉綠素b含量，顯著提高了懷白菊的NR活力、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量，且葉綠素a、葉綠素b含量增幅最大值出現(xiàn)的時(shí)間（繼代22 d）和NR活力、游離脯氨酸含量最高增幅出現(xiàn)的時(shí)間（繼代22 d）相吻合，進(jìn)一步說(shuō)明了植物氮代謝與葉綠素含量及光合能力具有相關(guān)性，且TAV脫除有利于提高懷白菊的光合能力和氮代謝水平。

為進(jìn)一步探討TAV脫除對(duì)懷白菊光合及氮代謝的影響，今后還應(yīng)對(duì)TAV脫除對(duì)懷白菊葉綠素?zé)晒鈪?shù)、光合特性參數(shù)（如凈光合速率、氣孔導(dǎo)度等）等指標(biāo)及NR基因表達(dá)等方面進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，TAV脫除能夠有效提高懷白菊葉片葉綠素含量及氮代謝水平，利于其生長(zhǎng)發(fā)育，為懷白菊脫毒苗的大田推廣應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 王 暉）