劉雷　 羅英　陶紅　姜立春　徐應(yīng)文　劉群　黃坤

摘 要 利用RACE技術(shù)從艾草（Artemisia argyi）的成熟葉片中克隆了萜類化合物生物合成的單萜合成酶（TPS）的基因，并對(duì)其進(jìn)行序列特征分析和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，該基因cDNA全長(zhǎng)為1.7 kb，開放閱讀框可編碼538個(gè)氨基酸殘基，并包含與其功能高度相關(guān)的DDxxD保守區(qū)和RR（degenerated RRx8W）保守區(qū)。預(yù)測(cè)的AaTPS二級(jí)結(jié)構(gòu)具有28個(gè)轉(zhuǎn)角，30個(gè)α螺旋，8個(gè)β折疊。預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)符合單萜合酶的立體構(gòu)象。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，AaTPS基因與其他雙子葉植物中的單萜合酶基因聚為一類，與菊科植物的單萜合酶基因相似性較高。

關(guān)鍵詞 艾草；單萜合酶基因；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào) S567.23；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To obtain the indispensable key enzyme involved in the monoterpene biosynthesis， the monoterpene synthase gene（TPS）was cloned and analyzed from Artemisia argyi through RACE. Results showed that the clones of cDNA were 1.7 kb on average， and contained an open reading frame（ORF）predicting a polypeptide of 538 amino acids（aa）， with a transit peptide and highly conserved DDxxD motif and RR（degenerated RRx8W）motif. Prediction of secondary structure and subcellular localization suggested that the protein might be encoded by AaTPS containing 28 coils， 30 alpha helixes， and 8 beta strands. The prediction of the three-dimensional structure conformed to spatial conformat of monoterpene synthase. Phylogenetic analysis indicated that AaTPS grouped with other dicotyledonous plant mono-TPS， and subgrouped in the composite family.

Key words Artemisia argyi； Monoterpene synthase； Phylogenetic analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.017

艾草（Artemisia argyi）又名香艾、艾蒿，為菊科蒿屬多年生草本植物。具有散寒止痛、溫經(jīng)止血、平喘鎮(zhèn)咳、止血祛痰、鎮(zhèn)靜免疫等功效[1-3]，對(duì)瘧疾、肝炎、癌癥、過敏和炎癥等癥狀都有良好的治療效果，并且能抑制由真菌、細(xì)菌和病毒等引起的傳染疾病的發(fā)生和傳播[4-5]。除藥用價(jià)值外，艾草因其獨(dú)特的芳香氣味，深受人們喜愛，常用于制作糕餅、炒菜、燉湯等，同時(shí)對(duì)降血壓、降血脂、緩解心血管疾病均有較好的食療作用，是一種典型的保健蔬菜[6]。隨著科學(xué)技術(shù)的普及、生活水平的提高和生活質(zhì)量的改善，人們的健康意識(shí)和環(huán)境意識(shí)日益增強(qiáng)，純天然的藥物和功能性食品越來(lái)越受到廣大消費(fèi)者的青睞[7]。艾草作為廣為流傳和應(yīng)用廣泛的藥用植物，其研究開發(fā)利用蘊(yùn)藏著巨大的經(jīng)濟(jì)效益和良好的社會(huì)效益。

艾草富含揮發(fā)油，其中以單萜類化合物最為豐富，是重要的香味物質(zhì)[8-13]，具有良好的藥用活性和抗菌效果[14-17]。植物單萜類成分在醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等方面有著廣泛的用途，是植物揮發(fā)油中極具價(jià)值的部分[8-9]。同時(shí)，單萜也是一類重要的防御性次生代謝產(chǎn)物，在抗病、抗蟲、耐旱、防紫外線等方面發(fā)揮著重要的作用[18-20]。

單萜合酶（monoterpene synthases， mono-TPS）是單萜生物合成過程中的關(guān)鍵酶，其作用是將單萜類化合物的共同前體物質(zhì)香葉基焦磷酸（Geranyl diphosphate， GPP）環(huán)化成立體化學(xué)構(gòu)象各異的單萜類化合物[18-19]。自Colby等[21]從留蘭香（Mentha spicata）中克隆到第一個(gè)4S-檸檬烯合酶基因以來(lái)，現(xiàn)已獲得了幾十個(gè)物種上百個(gè)單萜合酶基因，包括擬南芥（Arabidopsis thaliana）[22]、玉米（Zea mays L.）[23]、芒果（Mangifera indica L.）[24]、番茄（Lycopersicon esculentum）[25]等。這些成果主要以美國(guó)、德國(guó)、加拿大、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家為主，而國(guó)內(nèi)僅在青蒿[26-27]、 檀香[28]、赤桉[29]等物種上有一些研究。單萜合酶基因進(jìn)化頻率高，而目前分離得到的基因涉及物種較少，需要克隆更多基因以全面認(rèn)識(shí)單萜合酶系統(tǒng)發(fā)育和功能進(jìn)化。因此，mono-TPS早已成為科研工作者的關(guān)注焦點(diǎn)[30]。

先前對(duì)艾草的研究主要集中在有效化學(xué)成分的提取、分離及活性研究上[8-17]。對(duì)艾草揮發(fā)油積累機(jī)理未見報(bào)道。由此，本研究擬從艾草中克隆得到關(guān)鍵酶艾草單萜合酶基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為了解艾草單萜生物合成的分子機(jī)制，調(diào)控艾草單萜類化合物的產(chǎn)量以及提高艾草綜合利用價(jià)值奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用艾草（Artemisia argyi H. Lév. & Vaniot）的成熟葉片作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Labgene Biotechnology Co.， Ltd.）提取總RNA，利用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa Bio Inc.）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA。

1.2.2 基因保守片段的克隆 根據(jù)NCBI上其他植物mono-TPS基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)引物PF1：5′-GAATTTAGCAGCATTCAACT-3′和PR1：5′-CATTT

CCATGACATGCTCACG-3′； PCR反應(yīng)總體積為50 μL，1.5 mmol/L MgCl2，4種dNTPs各200 μmol/L，引物各150 ng，1.5 U Taq plus DNA polymerase，100 ng cDNA。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-T easy Vector 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞，采用藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，篩選的陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證后測(cè)序，獲得BbTPS基因片段。

1.2.3 3′ RACE克隆 采用SMART RACE cDNA amplification kit（Clontech Laboratories， Inc.），擴(kuò)增目的基因的3′末端。取4 μL總RNA作為模板，用

3′-CDS primerA（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGA

GTAC（T）30VN-3′）逆轉(zhuǎn)錄合成3′-RACE ready cDNA作為3′-RACE模板。以下游通用引物和每個(gè)基因的3′特異引物進(jìn)行降落PCR擴(kuò)增。降落PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)，72 ℃ 8 min。3′ RACE PCR產(chǎn)物亞克隆入pMDl8-T載體（TaKaRa Bio Inc.），測(cè)序。

1.2.4 5′ RACE克隆 根據(jù)所獲得的保守區(qū)域的序列，利用SMART RACE cDNA amplification kit 擴(kuò)增目的基因的5′末端。4 μL總RNA作為模板，用5′-CDS primer A（5′-（T）25VN-3′）逆轉(zhuǎn)錄合成5′ -RACE ready cDNA作為5′ RACE模板。以UPM和e15rcl87為引物進(jìn)行第一輪降落PCR：上游通用引物UPM（Universal Primer Mix）。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物1 ∶ 100稀釋作為模板，以NUP和基因5′ RACE特異引物進(jìn)行巢式降落PCR。上游通用引物mNUP下游基因特異性引物5′ RACE2兩輪降落PCR反應(yīng)程序均同上。5′ RACE PCR產(chǎn)物亞克隆入pMDl8-T載體，測(cè)序。

1.2.5 全長(zhǎng)cDNA的克隆 根據(jù)對(duì)3′/5′端序列以及基因片斷的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，艾草AaTPS基因各個(gè)拷貝均能很好的匹配，進(jìn)行電子拼接，得到艾草AaTPS基因全長(zhǎng)cDNA序列，然后分別以起始密碼子上游和端終止子下游區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物（上游引物：CTTTATCAAACCGAGTTATGGAGG；下游引物：CTTGGTGAGTTGGATTTTTCTTC），擴(kuò)增得到基因編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA序列。擴(kuò)增體系、反應(yīng)程序、亞克隆及測(cè)序等同5′-RACE。

1.2.6 序列分析 引物設(shè)計(jì)使用Primer 5.0完成；氨基酸序列翻譯、比對(duì)及親/疏水性在DNAMAN軟件（version 4.0，Lynnon Biosoft，Quebec）中進(jìn)行分析。在丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心（http：//www.cbs. dtu.dk/services/）分別使用TMHMM、SignalP、TargetP程序分別對(duì)信號(hào)肽切割位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。在DNAstar軟件中對(duì)艾草AaTPS基因進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。多重比對(duì)在Clustal X1.83 軟件中進(jìn)行，參數(shù)為默認(rèn)，分析保守區(qū)的組成及變化規(guī)律。將序列比對(duì)結(jié)果輸出至MEGA4軟件中，并利用MEGA4構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，方法為鄰近法（Neighbor-joining method， NJ）。進(jìn)化分支上的置信度通過500次自展重復(fù)計(jì)算獲得[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾草AaTPS cDNA序列分析

通過其他植物單萜合酶基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增得到約600 bp的DNA序列，預(yù)計(jì)包含200個(gè)氨基酸殘基，通過比較該序列與NCBI中其他植物序列發(fā)現(xiàn)，與其他植物中單萜合酶基因的序列相似性較大。在編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，通過3′ RACE和5′ RACE技術(shù)，獲得基因片段的兩端側(cè)翼序列，并進(jìn)行拼接。再?gòu)拈_放閱讀框兩端設(shè)計(jì)引物，獲得該基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，總長(zhǎng)度1 742 bp，包含1 614 bp的開放閱讀框，編碼538個(gè)氨基酸序列殘基，分子量約為62.254 ku（圖1）。

2.2 氨基酸序列分析

對(duì)艾草AaTPS基因氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列包含538個(gè)氨基酸殘基，分子量約為62.254 ku。通過與其他植物的單萜合酶的多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，艾草AaTPS與其他植物TPS基因相似度在54%左右。艾草AaTPS氨基酸序列中包含與其功能密切相關(guān)的保守區(qū)DDxxD和保守區(qū)RR（圖2）。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過對(duì)AaTPS基因與其他物種相關(guān)基因建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有植物類單萜合酶可分為兩大類，即單子葉植物類和雙子葉植物類。另外，還可以發(fā)現(xiàn)，來(lái)自相同科、或?qū)俚闹参锉痪墼谝黄?，如Fragaria vesca， Fragaria vesca subsp， Fragaria x ananassa， Rosa rugosa， Malus domestica and Prunus persica。艾草單萜合酶AaTPS被聚在雙子葉植物類中，與Actinidia arguta， Actinidia chinensis， Antirrhinum majus and Solanum lycopersicum等植物一起組成一個(gè)亞類（圖3）。

2.4 蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)艾草AaTPS氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明AaTPS包含28個(gè)轉(zhuǎn)角，30個(gè)α螺旋，8個(gè)β折疊（圖4）。親水性分析結(jié)果表明AaTPS氨基酸序列以疏水性區(qū)域?yàn)橹?。根?jù)親水區(qū)/疏水性區(qū)分布情況，AaTPS氨基酸序列可分為三大區(qū)域，即由疏水性氨基酸區(qū)段主導(dǎo)的N端、由親水性氨基酸和疏水性氨基酸交替分布的C端前端、由疏水氨基酸區(qū)段主導(dǎo)C端末端（圖4）。這種親/疏水性區(qū)段分布可能與催化中心所執(zhí)行親電催化機(jī)理有著密切相關(guān)。

基于鼠尾草單萜合酶的晶體結(jié)構(gòu)模型成功預(yù)測(cè)到艾草AaTPS的三維結(jié)構(gòu)。根據(jù)QMEAN4 綜合分值判斷其預(yù)測(cè)結(jié)果較為理想，其模型近似于真實(shí)AaTPS立體結(jié)構(gòu)。立體構(gòu)象結(jié)果表明，攜帶氨基酸保守區(qū)DDXXD（氨基酸序列中的287-291aa）的核心催化區(qū)位于該酶的功能域中心，以保守區(qū)RR為核心的N端保護(hù)區(qū)域倒扣在核心催化區(qū)外圍，從而對(duì)親電催化環(huán)境形成保護(hù)作用。這也反映了DDXXD和RR兩大保守區(qū)在單萜合酶催化功能中的重要性（圖5）。

3 討論

本研究成功從艾草中克隆到單萜合酶基因，但其催化功能有待進(jìn)一步研究。以上序列分析結(jié)果表明，該基因?qū)?yīng)的氨基酸序列具備幾乎所有單萜合酶都具有兩大典型保守區(qū)，即位于C端的富含天冬氨酸的保守性結(jié)構(gòu)“DDXXD”和位于N端的富含精氨酸的“RRx8W”保守區(qū)[19]。同時(shí)，聚類分析表明，該酶與來(lái)源于其他雙子葉植物Actinidia arguta，Actinidia chinensis，Antirrhinum majus and Aolanum lycopersicum的單萜合酶聚在一個(gè)亞類。經(jīng)預(yù)測(cè)，該酶的二級(jí)折疊結(jié)構(gòu)，三維立體結(jié)構(gòu)以及親水性/疏水性區(qū)域分布完全符合單萜合酶的基本特征。因此，可以初步判斷本研究獲得的基因編碼單萜合酶。然而，有研究表明，相同功能的單萜合酶基因在序列上有可能千差萬(wàn)別，而相同物種來(lái)源的不同單萜合酶基因間的相似性往往高于不同物種來(lái)源而具有相同功能的單萜合酶[31-38]。因此，基于本研究所獲得的序列信息還無(wú)法判定該酶催化產(chǎn)物的單萜種類。后續(xù)研究需通過基因工程方式獲得該酶的重組蛋白，建立以GPP為底物的催化體系，測(cè)定其催化產(chǎn)物的單萜種類，從而確定該酶屬于哪一種單萜合酶。

該酶的催化產(chǎn)物可能包含環(huán)狀單萜。植物單萜合酶的N端精氨酸保守區(qū)域RRx8W除了有維護(hù)C端核心催化區(qū)域的疏水環(huán)境外，還有重要的環(huán)化異構(gòu)功能[37]。前人研究表明，催化產(chǎn)生環(huán)狀單萜檸檬烯的單萜合酶，被人為改造去掉RRx8W保守序列后，催化產(chǎn)物就只有鏈狀單萜而沒有環(huán)狀單萜。當(dāng)然，在自然界中也一些單萜合酶丟失了RRx8W保守區(qū)，盡管這種現(xiàn)象極為罕見，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）沉香醇合酶，催化產(chǎn)生的多種單萜中同樣沒有鏈狀單萜[38]。雖然本研究獲得的艾草單萜合酶的RRx8W保守區(qū)域已退化成兩個(gè)RR殘基，但是前人研究發(fā)現(xiàn)在一些RRx8W保守區(qū)退化成RR的植物單萜合酶，其催化產(chǎn)物中仍然有部分環(huán)狀單萜產(chǎn)生[37]。因此，推測(cè)艾草單萜合酶可能具有同樣的環(huán)化能力。由于環(huán)狀單萜可形成的空間構(gòu)象變化較鏈狀單萜更為豐富，因此這一能力將使艾草獲得更多不同生理生態(tài)意義的單萜物質(zhì)，進(jìn)而在對(duì)食草動(dòng)物產(chǎn)生拒食效果、抗氧化、抵御病害方面發(fā)揮重要作用。

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