曾文丹　陸柳英　謝向譽(yù)　嚴(yán)華兵

摘 要 通過(guò)對(duì)不同優(yōu)良木薯品種體細(xì)胞胚胎及芽器官發(fā)生能力進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明，不同品種之間的體細(xì)胞胚胎和芽器官發(fā)生能力因基因型不同而差異顯著。KU 50體細(xì)胞胚發(fā)生率最高，為81.33%，其次為SC 205，誘導(dǎo)率為61.33%。而RYG 60未成功誘導(dǎo)出初生體細(xì)胞胚。誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚經(jīng)循環(huán)繼代培養(yǎng)可形成次生胚狀體。將次生胚狀體轉(zhuǎn)入成熟培養(yǎng)基，經(jīng)光培養(yǎng)后可形成綠色的成熟體細(xì)胞胚，進(jìn)而再生成植株。以KU 50體細(xì)胞胚萌發(fā)率最高，為42.2%。以子葉為外植體比以膨大的腋芽為外植體誘導(dǎo)初生體細(xì)胞胚的發(fā)生率高，除SC 205和NZ 199外，其余品種的誘導(dǎo)率均在85%以上。其中以新選048誘導(dǎo)效果最好，可達(dá)91.67%。將子葉切片置于器官發(fā)生培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，誘導(dǎo)頻率變幅為12.3%～71.0%，其中MCol 22和新選048誘導(dǎo)效果較好。

關(guān)鍵詞 木薯；基因型；體細(xì)胞胚胎發(fā)生；芽器官發(fā)生；再生植株

中圖分類號(hào) S533 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract A comparative study of the capacity of somatic embryogenesis and shoot organogenesis using different cassava cultivars was done. The results showed that there was a significant difference in the capacity of somatic embryogenesis and shoot organogenesis between different cassava cultivars due to different genotypes. Incidence of the somatic embryo of KU 50 was the highest，thatwas 81.33%； and the next was the SC 205， that was 61.33%. And the somatic embryo of RYG 60 was not induced. Secondary SE was establised in mature medium to induce green mature somatic embryogenesis and then the plants were grown after culture using light. Somatic embryo germination rate of KU 50 was the highest，that was 42.2%. Inducing rate of primary somatic embryos using the cotyledon was higher than using swollen axillary buds. Inducing ratewas over than 85% in all varieties except SC 205 and NZ 199. The inducing effect of Xinxuan 048 was the best， that was 91.67%. The formation of adventitious buds could be induced though cotyledons slice were incubated in organ culture medium and the inducing rate was between 12.3% and 71.0%； The inducing effect of MCol 22 and Xinxuan 048 was the best.

Key words Cassava； Genotype； Somatic embryogenesis； Shoot organogenesis； Plant regeneration

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.001

木薯（Manihot esculenta Crantz）用途廣泛，不僅是非洲地區(qū)重要的糧食作物和世界重要的工業(yè)原料，且在生物能源開(kāi)發(fā)和利用中占有非常重要的地位，經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力大[1-3]。木薯遺傳背景復(fù)雜，有性子代分離嚴(yán)重，為典型的無(wú)性繁殖作物，加上生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，開(kāi)花難、花粉育性低、自交不親和、坐果率低等因素，應(yīng)用常規(guī)育種技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)品種的目標(biāo)性狀的定向遺傳改良[4-5]?；蚬こ碳夹g(shù)是將一些重要的農(nóng)藝性狀基因（如抗病、抗蟲(chóng)，產(chǎn)量和品質(zhì)等）導(dǎo)入目的作物，實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物定向改良的一種快速育種手段。倪萬(wàn)潮等[6]將人工合成的Cry1A基因?qū)朊藁ǎ@得了高抗棉鈴蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植株。Lucca等[7]采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高了水稻植株對(duì)鐵元素的生物利用率和吸收率，使大米中鐵元素含量明顯增加。與其他作物相比，木薯的生物技術(shù)起步晚，自1982年Stamp等[8]首次報(bào)道木薯體細(xì)胞胚發(fā)生以來(lái)，大多的研究主要針對(duì)非洲和南美洲的一些傳統(tǒng)品種（如TMS60444）的體細(xì)胞胚研究。我國(guó)木薯體細(xì)胞胚發(fā)生和再生植株的報(bào)道主要是集中在外植體選擇、激素和碳源種類及濃度的篩選、培養(yǎng)方式等影響因子[9-13]。對(duì)多數(shù)木薯品種誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生能力而言，以Picloram比2，4-D誘導(dǎo)效率高[14]。Groll等[15]研究發(fā)現(xiàn)次級(jí)體細(xì)胞胚在含活性炭和0.1 μmol/L ABA的培養(yǎng)基上能更快速的分化和萌發(fā)；在體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基中添加活性炭更有助于體細(xì)胞胚的成熟。Mathews等[16]認(rèn)為體細(xì)胞胚成熟后經(jīng)脫水處理，可顯著提高體細(xì)胞胚的再生率。張鵬等[17]研究發(fā)現(xiàn)在芽器官發(fā)生培養(yǎng)基中添加AgNO3可明顯增加木薯不定芽的發(fā)生能力，增加再生芽的數(shù)量。

構(gòu)建離體再生體系是開(kāi)展生物技術(shù)的基礎(chǔ)。木薯離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化與基因型密切相關(guān)，探討不同基因型品種間的高效再生體系已成為當(dāng)前木薯基因工程研究的重要課題。本研究擬采用木薯體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及其植株再生培養(yǎng)技術(shù)[18-19]，分析比較優(yōu)良木薯品種間體細(xì)胞胚發(fā)生率及芽器官發(fā)生率，篩選出適宜于木薯植株再生體系構(gòu)建的優(yōu)良品種，為木薯品種基因工程改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以木薯品種新選048、SC 205、NZ 199、MCol 22、KU 50、R-90、RYG 60為試驗(yàn)材料。材料以試管苗的形式在基本培養(yǎng)基CBM上繼代保存。CBM培養(yǎng)基成分：MS鹽及其維生素、0.5 mg/L CuSO4、2%蔗糖和0.6%瓊脂粉。pH值為5.8。繼代培養(yǎng)條件：溫度（27±1） ℃、光照時(shí)間16 h/d、光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。

1.2 方法

1.2.1 不同品種間體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生能力

（1）體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。選取繼代培養(yǎng)3～4周的組培苗，切去其頂芽后將帶側(cè)芽的莖段水平放置誘導(dǎo)芽膨大培養(yǎng)基CAM（CBM+10 mg/L 6-BA）上，采用16 h/d光照培養(yǎng)3～5 d，在體式顯微鏡下用5號(hào)針頭挑取膨大的腋芽，放置體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM（CBM+12 mg/L Picloram）上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚。每個(gè)處理接種4個(gè)平皿，每個(gè)平皿接種芽分生組織25個(gè)，重復(fù)3次。接種后暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（27±1） ℃，每4～5 d觀察1次，14 d后統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率及其產(chǎn)胚量。

（2）體細(xì)胞胚的繼代培養(yǎng)與次生胚狀體的形成。將誘導(dǎo)的初生體細(xì)胞胚從培養(yǎng)組織塊剝離，置于新鮮相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，誘導(dǎo)和擴(kuò)增次生胚狀體。2～3周后繼代1次，觀察并統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚增殖速率。

（3）體細(xì)胞胚的成熟與萌發(fā)。將次生體細(xì)胞胚移置成熟培養(yǎng)基CMM（CBM+0.1 mg/L 6-BA），采用光照培養(yǎng)直至子葉明顯長(zhǎng)大并變綠。每個(gè)處理接種4個(gè)平皿，每個(gè)平皿接種25個(gè)外植體，重復(fù)3次。14 d后統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚成熟率。將成熟胚轉(zhuǎn)移置CBM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)萌發(fā)，30 d后統(tǒng)計(jì)成苗率。培養(yǎng)條件：溫度（27±1） ℃、光照時(shí)間16 h/d、光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。

（4）體細(xì)胞胚子葉誘導(dǎo)次生體細(xì)胞胚的發(fā)生。取誘導(dǎo)14 d后的成熟子葉為外植體，用解剖刀切成大小為0.04～0.25 cm2子葉切片，移置體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM上，采用暗培養(yǎng)誘導(dǎo)次生胚狀體。每個(gè)處理接種4個(gè)平皿，每個(gè)平皿接種外植體25個(gè)，重復(fù)3次。

1.2.2 不同品種間芽器官發(fā)生能力

（1）成熟體細(xì)胞子葉切片誘導(dǎo)芽器官的發(fā)生。取誘導(dǎo)14 d后的成熟子葉為外植體，用解剖刀切成大小為0.04～0.25 cm2子葉切片，移置芽器官發(fā)生培養(yǎng)基COM（CBM+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+4 mg/L AgNO3）上。每個(gè)處理接種4個(gè)平皿，每個(gè)平皿接種25個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同誘導(dǎo)體細(xì)胞胚成熟。3周后觀察不定芽誘導(dǎo)情況。將帶有芽原基及其再生不定芽的膨大培養(yǎng)小塊轉(zhuǎn)入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基CEM（CBM+0.4 mg/L 6-BA），經(jīng)培養(yǎng)后獲得再生苗。

（2）不定芽生根培養(yǎng)。將上述再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（1/2 MS+0.02 mg/L NAA+20 g/L蔗糖）中進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同誘導(dǎo)體細(xì)胞胚成熟。

1.2.3 再生植株的移栽 待組培幼苗生長(zhǎng)健壯、根系較發(fā)達(dá)，株高長(zhǎng)至5 cm左右時(shí)，移入溫室煉苗，放置7 d左右，擰松瓶蓋，使瓶?jī)?nèi)環(huán)境與外界相當(dāng)，讓組培苗在自然狀態(tài)下馴化3～5 d后，洗凈幼苗附著的培養(yǎng)基，移植于栽培基質(zhì)（泥沙 ∶ 草炭土=1 ∶ 2）中。30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0和Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同木薯品種初生體細(xì)胞胚的發(fā)生及其繼代增殖

挑取膨大的芽分生組織（圖1-A），放置到體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)初生體細(xì)胞胚（圖1-B）的形成。由表1可知，7個(gè)木薯品種均能成功誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生，除RYG 60外，其余木薯品種愈傷組織誘導(dǎo)率差異不顯著。且試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的愈傷組織類型不同，一類為非胚性愈傷組織，其愈傷組織透明，海綿狀，結(jié)構(gòu)疏松；另一類為胚性愈傷組織，其質(zhì)地較脆。所測(cè)試品種中KU 50體細(xì)胞胚發(fā)生率最高，為81.33%，其次為木薯品種SC 205，其誘導(dǎo)率為61.33%。RYG 60未成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚。木薯品種新選048、MCol 22、KU 50產(chǎn)胚量顯著高于其他品種，分別為4.2、5.0、4.6個(gè)。SC 205產(chǎn)胚量低，僅為1.97個(gè)。結(jié)果表明木薯品種的基因型是決定體細(xì)胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。

因隨著體細(xì)胞胚的繼代增殖，非胚性愈傷生長(zhǎng)速度較初生體細(xì)胞胚快，需于1周內(nèi)將誘導(dǎo)的初生體細(xì)胞胚剝離進(jìn)行繼代培養(yǎng)，誘導(dǎo)次生體細(xì)胞胚（圖1-C）的發(fā)生。在相同的繼代培養(yǎng)基上，胚狀體的增殖速率和形態(tài)也明顯受基因型的影響。木薯品種新選048、MCol 22、KU 50、R-90次生胚的發(fā)生率較高，在2周內(nèi)即可擴(kuò)增2倍以上，而SC 205和NZ 199次生體細(xì)胞胚發(fā)生率低。不同木薯品種所誘導(dǎo)的胚狀體形態(tài)也各不相同（圖2）。

2.2 體細(xì)胞胚的成熟和萌發(fā)

將次生體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)置于成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)。14 d左右，體細(xì)胞胚明顯膨大并形成綠色成熟子葉胚（圖1-D）。由表2可見(jiàn)，除SC 205、NZ 199外，其余品種胚狀體成熟率均在80%以上。將成熟體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入CBM培養(yǎng)基誘導(dǎo)植株再生。其中，KU 50成苗率最高，為42.2%，SC 205成苗率最低，為6.2%。其他品種的成苗率為25%～35%。

2.3 成熟胚狀體子葉切片誘導(dǎo)次生體細(xì)胞胚發(fā)生

取誘導(dǎo)14 d的成熟子葉作為外植體，用解剖刀將其切成0.04～0.25 cm2的子葉切片（圖1-E），移置CIM培養(yǎng)基誘導(dǎo)次生胚狀體。培養(yǎng)5 d左右，子葉切口邊緣形成愈傷組織，繼續(xù)暗培養(yǎng)，愈傷組織邊緣形成球狀胚，最終胚狀體逐漸增多并長(zhǎng)大（圖1-F）。由表3可知，以子葉為外植體，體細(xì)胞胚的發(fā)生率比以膨大的腋芽為外植體高。所測(cè)品種中，新選048體細(xì)胞胚發(fā)生率最高，為91.67%，產(chǎn)胚量為8.47個(gè)。MCol 22、KU 50、R-90體細(xì)胞胚發(fā)生率均在80%以上。NZ 199體細(xì)胞胚發(fā)生率最低，僅為30.33%，產(chǎn)胚量為1.67個(gè)。

2.4 成熟胚狀體子葉切片誘導(dǎo)芽器官發(fā)生

取誘導(dǎo)14 d的成熟子葉切片移置芽器官發(fā)生培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽。光照培養(yǎng)3～5 d后，切片邊緣先形成愈傷組織，部分子葉邊緣向上卷曲，繼續(xù)培養(yǎng)10 d左右，子葉切片的切口處形成芽原基，進(jìn)而發(fā)育成從生小芽（圖1-G）。由圖3可知，不同基因型品種其芽器官的發(fā)生能力存在顯著差異。其中以MCol 22和新選048子葉不定芽的發(fā)生率較高，分別為71%和62%。而NZ 199子葉不定芽的發(fā)生率僅為12.3%。

2.5 再生植株的移栽與成活

將體細(xì)胞胚萌發(fā)及芽器官發(fā)生所形成的小苗（圖1-H）轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4～6周后形成再生植株（圖1-I）。

由圖4可知，基因型對(duì)木薯的移栽成活率也有一定程度的影響。所測(cè)試的6個(gè)品種中，新選048、MCol 22、NZ 199移栽成活率均達(dá)到80%以上，其中以MCol 22移栽成活率最高，為89.5%。R-90的移栽成活率最低，為66.4%。

3 討論

建立一套高效的植株再生及基因轉(zhuǎn)化體系是利用基因工程開(kāi)展作物遺傳改良的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。木薯的離體植株再生途徑分為兩種，即器官和體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑。其中器官發(fā)生途徑又分為間接器官發(fā)生途徑和直接器官發(fā)生途徑[20]。本研究借鑒并優(yōu)化了張鵬等[18]和Bull等[19]的木薯體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及植株再生方法，研究不同優(yōu)良木薯品種的體細(xì)胞胚直接再生途徑和子葉誘導(dǎo)不定芽器官發(fā)生途徑。目前，木薯體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)大部分以膨大的腋芽為外植體進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)部分木薯品種（如新選048）以膨大的腋芽為外植體，體細(xì)胞胚的發(fā)生率僅為40.33%，而以子葉切片為外植體，誘導(dǎo)率高達(dá)91.67%；此外，在顯微鏡下挑取膨大的腋芽進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)，需要豐富的經(jīng)驗(yàn)和嫻熟的技術(shù)，人為因素誤差大，不宜大規(guī)模培養(yǎng)。而以子葉切片為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生操作簡(jiǎn)單，且誘導(dǎo)率高，是理想的外植體材料。

本實(shí)驗(yàn)7個(gè)供試品種中，KU 50的植株再生率最高，但僅為42.2%。由此可見(jiàn)，木薯體細(xì)胞胚直接再生植株仍存在一定的困難。這與朱文麗等[13]的研究結(jié)果一致。因此，如何通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，提高木薯體細(xì)胞胚直接再生率，有待下一步的研究和完善。

初生體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和芽器官發(fā)生受基因型影響很大，雖然初生體細(xì)胞胚可以通過(guò)不同誘導(dǎo)條件獲得，但不同品種間的誘導(dǎo)率存在顯著差異[22]。Dohm等[23]選用50個(gè)月季品種進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)，結(jié)果表明僅有69%的品種成功誘導(dǎo)初生體細(xì)胞胚，并且不同品種間誘導(dǎo)率差異顯著。Pelissier等[24]和黃先群等[25]探討了不同基因型向日葵體細(xì)胞胚的發(fā)生能力，結(jié)果表明不同基因型之間的體細(xì)胞胚發(fā)生率和平均胚數(shù)差異達(dá)到極顯著水平。方佳敏等[5]和趙珊珊等[14]研究發(fā)現(xiàn)不同木薯品種之間的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和芽器官發(fā)生能力因基因型不同而差異顯著。本實(shí)驗(yàn)對(duì)7個(gè)不同木薯品種的體細(xì)胞胚和不定芽發(fā)生能力的研究表明，基因型起著關(guān)鍵作用。在體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)、繼代、成熟、再生以及芽器官發(fā)生等培養(yǎng)過(guò)程中，品種間的差異明顯，特別是初生體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率其差異達(dá)到極顯著水平。以誘導(dǎo)彭大的腋芽為外植體時(shí)，KU 50其誘導(dǎo)率達(dá)到81.33%，而RYG 60的誘導(dǎo)率為0。以子葉為外植體時(shí)，新選048的誘導(dǎo)率達(dá)91.67%，而NZ 199的誘導(dǎo)率僅為30.33%。在不定芽發(fā)生率中，以MCol 22和新選048的誘導(dǎo)率分別為71.0%和62.0%。SC 205和NZ 199的發(fā)生率較低，僅為17.3%和12.3%。木薯模式品種TMS60444已建立了成熟的脆性胚性愈傷體系結(jié)合農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法，成功獲得抗木薯非洲花葉病毒、蛋白質(zhì)改良等轉(zhuǎn)基因品系。而在其他品種鮮有成功的試驗(yàn)報(bào)道。因此，通過(guò)開(kāi)展不同優(yōu)良木薯品種的此類研究，擴(kuò)寬優(yōu)良基因型的選擇，對(duì)木薯基因育種工程具有重要意義。本試驗(yàn)所試木薯品種新選048具有長(zhǎng)勢(shì)旺、適應(yīng)性強(qiáng)、豐產(chǎn)性好等特點(diǎn)，在生產(chǎn)上具有廣泛的應(yīng)用前景。其體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和芽器官再生能力都較強(qiáng)，是開(kāi)展國(guó)內(nèi)木薯轉(zhuǎn)基因育種、誘變育種的理想材料。木薯品種KU 50和SC 205體細(xì)胞胚發(fā)生能力較強(qiáng)，可通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基等條件的優(yōu)化提高其器官發(fā)生能力，也可作為下一步遺傳轉(zhuǎn)化品種的優(yōu)選品種。

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