陳曉鷺　劉立偉　楊全　龐玉新

摘 要 應(yīng)用冰凍切片法觀察艾納香成熟葉的顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，優(yōu)化的冰凍切片方法為：取新鮮葉片，不經(jīng)預(yù)處理，直接切取4 mm×4 mm小塊，用冷凝膠包埋，冷凝箱溫度和樣品夾溫度-18 °C，冷凝時(shí)間10 min，修片后取出并置于室溫20 ℃條件下回溫30 s，移回樣品夾后30 s內(nèi)切片，切片厚度20 μm，用潔凈載玻片吸片，于光鏡下觀察。成熟艾納香葉為異面葉，厚度約110 μm；柵欄組織和海綿組織分化明顯，柵欄組織由1層排列緊密的柱狀細(xì)胞組成，海綿組織有發(fā)達(dá)的細(xì)胞間隙，兩者之比為0.82～1.22；葉中脈發(fā)達(dá)，主脈散生，外韌維管束6～10個(gè)，由厚壁細(xì)胞組成維管束鞘，導(dǎo)管為螺紋；葉上、下表皮均有大量非腺毛和腺毛分布，葉表皮的腺毛為雙列多細(xì)胞組成的頭狀腺毛。本研究結(jié)果確定了利用冰凍切片研究艾納香葉顯微結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)便可行，為艾納香屬植物分類鑒定、品種整理等提供參考，并為進(jìn)一步研究艾納香的結(jié)構(gòu)和發(fā)育積累經(jīng)驗(yàn)。

關(guān)鍵詞 艾納香；娜龍；葉；腺毛；顯微結(jié)構(gòu)；冰凍切片

中圖分類號(hào) Q944.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract This paper studies the microstructure of sambongs leaf by freeze-sectioning. The optimized method is to collect a fresh and healthy adult leaf and cut a piece from it with an area of 4 mm×4 mm without pretreatment. Then the piece is embedded with Jung tissue freezing medium under -18 ℃ for 10 min， and then placed under room temperature at 20 ℃ for 30 seconds and cut under -18℃ within 30 s. The section thickness is 20 μm. A glass slide is used to stick the section. The section is observed with a optical microscope. The results showed that the ainaxiang leaf is typically bifacial and is with a thickness of about 110 μm. Palisade tissue and spongy tissue in leaves are differentiated. Palisade tissue is composes of columnar cells closely arranged one layer. Intercellular space of spongy tissue is developed. The ratio of palisade tissue thickness to spongy tissue thickness ranges from 0.82 ∶ 1 to 1.22 ∶ 1. Midrib is developed. Six to eight collateral vascular bundles are loosely arranged in midrib. Vascular bundle is consists of spiral vessels inside and sclerenchyma cells around as vascular bundle sheath. Both non-glandular hairs and glandular hairs are occurred frequently in both sides of adult leaves. The glandular hairs are capitate trichomes consists of several cells arrange in two lines. Above results confirm that the feasibility and convenience of studying ainaxiang leaf microstructure with freezing sections. This finding may help better taxonomical study of Blumea plants， and add some information for further study on microstructure and development of this plant.

Key words Blumea balsamifera；sambong；Leaf；Glandular hair；Microstructure；Freezing section

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.006

艾納香[Blumea balsamifera （L.） DC.]又名冰片艾、大風(fēng)艾，為多年生菊科（Asteraceae）艾納香屬木質(zhì)草本藥用植物，主要分布在中國(guó)的貴州、海南、廣東、臺(tái)灣等地以及菲律賓、越南、馬來(lái)西亞等國(guó)[1-2]，在中國(guó)少數(shù)民族地區(qū)又稱之為“娜龍”、“檔窩凱”等。艾納香具有開(kāi)竅醒神、清熱止痛等功效，已有數(shù)百年的藥用歷史，最主要藥用部位為葉，是提取中藥艾片（左旋龍腦）的唯一資源植物[3]，也是熱區(qū)新興的藥用經(jīng)濟(jì)作物[1]，目前艾納香植株及其提取物（如艾片、艾粉和艾納香油等）已被廣泛應(yīng)用于中成藥、化妝品、食品等領(lǐng)域。在長(zhǎng)期的民間使用過(guò)程中，由于艾納香植株外觀特性并不突出，缺乏獨(dú)特易辨的葉型、葉色、花型或花色等，導(dǎo)致把艾納香與同屬其他種的植物混淆使用的情況時(shí)有發(fā)生，如六耳鈴、柔毛艾納香等。由于誤用或種植了其他植物而影響治療效果或提取效率的情況時(shí)有發(fā)生。研究艾納香的顯微結(jié)構(gòu)將有助于理清艾納香屬植物的分類，為其植物學(xué)鑒定和分類補(bǔ)充資料，同時(shí)為了解和評(píng)價(jià)艾納香藥材質(zhì)量積累經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)而為艾納香良種選育提供參考。

近年來(lái)，圍繞艾納香已經(jīng)展開(kāi)多方面研究，包括植物資源[4-5]、化學(xué)成分分析[6-12]、提取工藝優(yōu)化[13-16]、藥理功效評(píng)價(jià)[17-20]、安全性評(píng)價(jià)[21-22]、功效基因克隆[23]和、田間栽培[24]和組培快繁[25]等，或是探討其不同生長(zhǎng)期的外觀形態(tài)變化[26]。

隨著艾納香的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益逐漸顯現(xiàn)，關(guān)于艾納香顯微結(jié)構(gòu)觀察、鑒定的研究也不斷增加。根據(jù)艾納香屬的經(jīng)典分類，艾納香的總苞片表皮毛全部為非腺毛，即沒(méi)有腺毛，這是區(qū)分艾納香與同屬其他種的重要形態(tài)學(xué)特征[5，27]，但是，以總苞片表皮毛作為鑒定特征，只能在植物進(jìn)入花期時(shí)進(jìn)行，使鑒定工作受限于植物生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，對(duì)于幼苗及其他非花期植株，則難以鑒定。林志云[28]利用中藥顯微鑒定技術(shù)研究后認(rèn)為，艾納香的表皮上存在腺毛和非腺毛；安軍等[29]通過(guò)石蠟切片研究認(rèn)為，艾納香表皮毛中絕大部分為非腺毛，僅偶見(jiàn)腺毛；池馨等[30]通過(guò)石蠟切片研究認(rèn)為，艾納香葉含有分泌細(xì)胞，但是，未闡明分泌細(xì)胞的類型和形態(tài)，也未指出其是否具有腺毛。前人通過(guò)直接觀察、石蠟切片和粉末觀察等方法為研究艾納香的顯微結(jié)構(gòu)積累了經(jīng)驗(yàn)，但關(guān)于其表皮毛的描述尚未達(dá)成一致。

冰凍切片技術(shù)操作便捷、耗時(shí)短，切片厚度可調(diào)范圍大，易于保留葉片表皮的毛狀結(jié)構(gòu)[31]。為進(jìn)一步了解艾納香的形態(tài)學(xué)特征，為其補(bǔ)充植物分類和鑒定資料，完善基于顯微觀察的艾納香評(píng)價(jià)手段，有必要利用冰凍切片技術(shù)對(duì)艾納香葉的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的植物材料引種自海南省儋州市郊，經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所南藥研究室龐玉新研究員鑒定，為艾納香屬植物艾納香。經(jīng)引種，保存在位于海南省儋州市的農(nóng)業(yè)部儋州熱帶藥用植物種質(zhì)資源圃中，露天栽培，常規(guī)水肥管理。

1.2 方法

1.2.1 冰凍切片方法的優(yōu)選 （1）不同冷凝溫度對(duì)艾納香葉冰凍切片的效果比較。取新鮮葉片，用鋒利刀片切取葉片中部至邊緣的一部分葉片，大小為4 mm×4 mm的方塊，使用冰凍切片機(jī)專用的萊卡 （Leica）Jung組織冷凍劑（批號(hào)：03663438 2013 06）在載物臺(tái)上直接包埋，分別在-10、-18、-28 ℃環(huán)境下冷凝10 min，修片后切片，切片厚度為20 μm，用潔凈載玻片吸貼，在Leica DMI4000B數(shù)碼光學(xué)顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍照，比較切片效果。

（2）不同冷凝時(shí)間對(duì)艾納香葉冰凍切片的效果比較。取新鮮葉片，用鋒利刀片切取葉片中部至邊緣的一部分葉片，大小為4 mm×4 mm的方塊，使用Jung組織冷凍劑在載物臺(tái)上直接包埋，分別于-18 ℃下冷凝5、10、30 min，修片后切片，切片厚度為20 μm，用潔凈載玻片吸貼，在Leica DMI4000B數(shù)碼光學(xué)顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍照，比較切片效果。

（3）不同回溫操作時(shí)間對(duì)艾納香葉冰凍切片的效果比較。取新鮮葉片，用鋒利刀片切取葉片中部至邊緣的一部分葉片，大小為4 mm×4 mm的方塊，使用Jung組織冷凍劑在載物臺(tái)上直接包埋，于-18 ℃下冷凝10 min后修片，分別回溫[32][將載物臺(tái)連同包埋塊拿到切片機(jī)冷凍箱外，在室溫（20 ℃）環(huán)境下放置一段時(shí)間，使包埋塊溫度回升]0、10、30、90 s后將其重新固定在樣品夾上，30 s內(nèi)切片，切片厚度為20 μm，用潔凈載玻片吸貼，在Leica DMI4000B數(shù)碼光學(xué)顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍照，比較切片效果。

1.2.2 艾納香葉片冰凍切片與觀察 試驗(yàn)采用優(yōu)化后的冰凍切片法對(duì)艾納香葉顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行切片，具體步驟：取潔凈健康無(wú)病蟲害的新鮮成熟葉片，用鋒利刀片切取葉片中部至邊緣的一部分葉片及葉片中部的主脈各一方塊（4 mm×4 mm），使用Jung組織冷凍劑固定，在載物臺(tái)上直接進(jìn)行包埋，分別在-18 ℃環(huán)境下冷凝10 min，待材料迅速冷卻并固定在載物臺(tái)上后進(jìn)行修片，回溫[32]30 s后重新將其固定在樣品夾上，在30 s內(nèi)進(jìn)行切片，切片厚度為20～30 μm，用潔凈載玻片吸貼[33]，在德國(guó)萊卡（Leica）DMI4000B數(shù)碼光學(xué)顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 包埋塊穩(wěn)定度按以下公式計(jì)算：包埋塊穩(wěn)定度/%=（1-修塊或切片過(guò)程中脫落的包埋塊個(gè)數(shù)/包埋塊總數(shù)）×100；照片經(jīng)Adobe Photoshop CC圖像處理系統(tǒng)處理制版；數(shù)據(jù)分析采用IBM公司的 SPSS（Statistical Product and Service Solutions）19.0軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)記錄格式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SD）。2組數(shù)據(jù)的差異顯著性分析使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；3組或以上數(shù)據(jù)的差異顯著性分析使用鄧肯氏多重范圍比較（Duncans New Multiple Range Test），差異顯著性水平定為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰凍切片方法的優(yōu)選

2.1.1 不同冷凝溫度對(duì)艾納香葉冰凍切片的效果比較 分別比較了冷凝溫度為-10、-18、-28 ℃（冷凝10 min時(shí)）的切片效果，結(jié)果見(jiàn)表1和圖1，包埋穩(wěn)定度隨冷凝溫度的下降而上升，冷凍箱和樣品夾的冷凝溫度均設(shè)定為-18 ℃時(shí)效果較好（圖1-A）。當(dāng)溫度為-10 ℃時(shí)，葉片橫切面結(jié)構(gòu)被擠壓變形，且修塊和切片過(guò)程中包埋塊容易脫落；當(dāng)溫度為-28 ℃時(shí)，葉片組織容易碎裂，造成切片不完整（圖1-B）。

2.1.2 不同冷凝時(shí)間對(duì)艾納香葉冰凍切片的效果比較 從表2可知，包埋穩(wěn)定度隨冷凝時(shí)間的延長(zhǎng)而上升。在-18 ℃冷凝10 min最適合，此時(shí)切片較完整（圖2-A）。冷凝時(shí)間為5 min時(shí)，冷凝膠未能完全凝固，且貼緊載物臺(tái)，在修片和切片的過(guò)程中，容易導(dǎo)致包埋塊滑落；冷凝時(shí)間為30 min時(shí)，樣品組織發(fā)生碎裂，難以觀察完整的組織形態(tài)（圖2-B）。

2.1.3 不同回溫操作時(shí)間對(duì)艾納香葉冰凍切片的效果比較 從表3可知，包埋穩(wěn)定度隨回溫時(shí)間的延長(zhǎng)而有所下降，但在90 s內(nèi)下降不顯著。在對(duì)艾納香葉進(jìn)行冰凍切片時(shí)，適當(dāng)進(jìn)行回溫操作有利于獲得結(jié)構(gòu)完整的切片。在冷凝溫度為-18 ℃、冷凝時(shí)間為10 min、室溫為20 ℃的條件下，回溫時(shí)間為30 s效果最佳（圖3-A）?；販貢r(shí)間為10 s時(shí)，切片結(jié)果與不進(jìn)行回溫操作的結(jié)果相似，均容易使組織破碎；回溫時(shí)間為90 s時(shí)，容易導(dǎo)致切片實(shí)際厚度大于設(shè)定的厚度，且艾納香的葉肉結(jié)構(gòu)變形（圖3-B）。

2.2 艾納香葉片冰凍切片與觀察

艾納香葉為羽狀網(wǎng)脈，成熟中脈和側(cè)脈在上面可辨，下面明顯凸起（圖4-A）。橫切面上，中脈最粗。葉中脈處，上表皮細(xì)胞與維管束之間靠近表皮處有6～9層細(xì)胞壁加厚的厚角組織，與兩邊的柵欄組織相連，厚角組織以內(nèi)有3～8層薄壁細(xì)胞。下表皮細(xì)胞外角質(zhì)層有明顯加厚，下表皮內(nèi)2～6層為厚角組織，其內(nèi)為6～7層較疏松的薄壁細(xì)胞，薄壁細(xì)胞較大，兩側(cè)與兩邊的海綿組織相連。上、下表皮均有大量表皮毛分布，有非腺毛和腺毛。葉中脈橫切面上，維管束呈扇形排列，為外韌維管束，約4～11個(gè)，維管束的韌皮部外有厚角組織構(gòu)成的維管柱鞘。木質(zhì)部導(dǎo)管為螺紋導(dǎo)管。

成熟葉片厚度為（110.19±1.01）μm，葉肉組織發(fā)達(dá)，柵欄組織和海綿組織的分化明顯。柵欄組織由1層排列較緊密的柱狀細(xì)胞構(gòu)成，厚度為（36.10±0.44）μm，含有豐富的葉綠體；海綿組織細(xì)胞排列較疏松，細(xì)胞間隙發(fā)達(dá)（圖4-B），厚度為（44.26±0.92）μm，柵海比為0.82～1.22。

葉片橫切面上、下表皮細(xì)胞大小相近，多為不規(guī)則形或近方形，葉脈下表皮處表皮細(xì)胞為規(guī)則的圓形或近方形（圖4-B）。上表皮厚度為（17.45± 0.42）μm，下表皮厚度為（7.87±0.22）μm，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，上表皮厚度顯著大于下表皮厚度。上、下表皮均可見(jiàn)非腺毛和腺毛分布，大部分腺毛長(zhǎng)度約為48 μm。腺毛的形態(tài)為頭狀腺毛，由基細(xì)胞、柄細(xì)胞和分泌細(xì)胞組成，其中，基細(xì)胞1個(gè)或2個(gè)并排，柄細(xì)胞1～2對(duì)并排形成，分泌細(xì)胞1～6對(duì)，頂部的分泌細(xì)胞由1對(duì)半球形細(xì)胞并排形成，在分泌細(xì)胞外可見(jiàn)由分泌物構(gòu)成的一層半透明囊泡包裹（圖4-C）。

3 討論與結(jié)論

前人對(duì)艾納香葉顯微結(jié)構(gòu)的研究主要是通過(guò)石蠟切片技術(shù)或中藥顯微鑒定的手段對(duì)包含葉在內(nèi)的全草粉末進(jìn)行顯微觀察[28-30]。相對(duì)于石蠟切片，本研究通過(guò)使用冰凍切片進(jìn)行操作，觀察和統(tǒng)計(jì)結(jié)果與前人利用石蠟切片所觀察到的葉肉部分的顯微結(jié)構(gòu)特征[30]一致，確定利用冰凍切片技術(shù)對(duì)艾納香葉的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察的方法可行。此外，利用冰凍切片操作具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)[31-32]，便于大量操作，在研究艾納香葉的數(shù)量性狀方面更具有較大的優(yōu)勢(shì)，如用于評(píng)估其顯微結(jié)構(gòu)差異與有效成分積累差異之間的關(guān)系等。

優(yōu)化后的艾納香葉冰凍切片方法為：取新鮮葉片，不經(jīng)預(yù)處理，直接切取4 mm×4 mm的小塊，用冷凝膠包埋，冷凝箱溫度和樣品夾溫度均為-18 ℃，冷凝時(shí)間為10 min，修片后取出并將其置于室溫（20 ℃）條件下回溫30 s，移回樣品夾后30 s內(nèi)切片，切片厚度為20 μm，用潔凈載玻片吸片，于光學(xué)顯微鏡明場(chǎng)下觀察并拍照記錄。

精油是艾納香葉中具有重要生物活性的內(nèi)含物[2，20-21]，而關(guān)于艾納香的精油分泌結(jié)構(gòu)的類型與特征尚未有定論。艾納香葉上、下表面均附有長(zhǎng)而濃密的非腺毛，不易移除，阻擋視線，增加了對(duì)葉表皮其他結(jié)構(gòu)直接觀察的難度。至今，關(guān)于艾納香表皮毛中是否存在腺毛及腺毛的多寡尚存在一些爭(zhēng)議[27-30]。本研究通過(guò)進(jìn)行冰凍切片，確定了腺毛大量存在于艾納香葉表面，獲得了完整、清晰的艾納香葉表皮腺毛的照片，可清晰地觀察到由雙列多細(xì)胞排列而成的頭狀腺毛。這些結(jié)果支持了部分學(xué)者認(rèn)為艾納香存在腺毛的觀點(diǎn)[29]，池馨等[30]雖未明確闡述艾納香表皮腺毛存在與否，但從其石蠟切片照片中可辨認(rèn)出部分結(jié)構(gòu)與本研究所觀察到的腺毛結(jié)構(gòu)一致。不過(guò)，在本研究的艾納香葉表皮中僅觀察到一種腺毛，即雙列多細(xì)胞排列的頭狀腺毛，未觀察到林志云[28]報(bào)道的單列細(xì)胞排列的頭狀腺毛，可能是因?yàn)楸狙芯坑^察對(duì)象為成熟葉片，而前人觀察的是全草粉末，即由于觀察的植物部位范圍不同或觀察的材料狀態(tài)不同所致。本研究結(jié)果確定利用冰凍切片技術(shù)觀察艾納香表皮毛的方法可行，且相對(duì)于石蠟切片而言，不需要有機(jī)溶劑固定，更快捷便利；相對(duì)于粉末顯微觀察而言，不需要進(jìn)行干燥、打粉等處理，對(duì)艾納香及更多植物的分類、鑒定、觀察具有參考價(jià)值；此外，通過(guò)本研究可知，艾納香表皮在非腺毛覆蓋之下具有大量腺毛，這也為從顯微結(jié)構(gòu)角度研究和評(píng)價(jià)艾納香精油的積累模式提供參考。

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