黃小楠　李奕星　李芬芳　陳嬌　袁德?！〗鹬緩?qiáng)

摘 要 MRPs作為天然抗褐變劑，可抑制引起果蔬酶促褐變的酪氨酸酶的酶活。為進(jìn)一步優(yōu)化美拉德反應(yīng)以制備酪氨酸酶活性抑制組分，本研究采用響應(yīng)面法對(duì)MRPs制備工藝進(jìn)行研究。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定美拉德反應(yīng)初始pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、底物濃度比（糖 ∶ 氨基酸）4個(gè)因素，設(shè)計(jì)4因素5水平的二次回歸中心組合試驗(yàn)。經(jīng)響應(yīng)面法分析，為方便實(shí)際操作，確定最佳工藝條件為：初始pH為2.94，反應(yīng)時(shí)間為1.9 h，反應(yīng)溫度為110.09 ℃，底物濃度比（糖 ∶ 氨基酸）為0.57。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得出結(jié)果與理論值相對(duì)誤差較小，故采用二次回歸中心組合設(shè)計(jì)得到的最優(yōu)MRPs制備條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞 響應(yīng)曲面；美拉德反應(yīng)；酪氨酸酶；活性抑制

中圖分類號(hào) S646.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract MRPs as the natural anti browning agent can inhibit tyrosine enzyme activity. In order to optimize the maillard reaction in the preparation of tyrosinase activity of components，the technique conditions of maillard reaction products preparation were studied by response surface method. Based on the single-factor tests， determining four factors ∶ the initial pH of maillard reaction，reaction temperature，reaction time and the substrate concentration ratio（sugar ∶ amino acids）and designing four factors and five levels quadratic regression test center combination. The conditions were optimized as：initial pH 2.94，reaction time 1.9 h，reaction temperature 110.09 ℃，the substrate concentration ratio（sugar，amino acids）0.57. After experimental verification，the results were close to the theoretical value and these predicted values were exact and reliable.

Key words Response surface；Maillard reaction；Tyrosinase；The inhibition of activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.025

褐變是果蔬采后及加工損失的重要原因之一，如香蕉、蘋果、蘑菇、蓮藕等。褐變分為酶促褐變和非酶促褐變，而酶促褐變占主導(dǎo)。酶促褐變是指酚類物質(zhì)在相關(guān)酶系催化下形成醌，并進(jìn)一步聚合形成褐色素等[1]。多酚氧化酶是對(duì)果蔬酶促褐變起關(guān)鍵作用的酶系，蘑菇中主要是酪氨酸酶（多酚氧化酶的一種）[2]。

美拉德反應(yīng)指氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白質(zhì)）和羰基化合物（糖類）之間發(fā)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)，美拉德產(chǎn)物（MRPs）是非酶促褐變反應(yīng)的產(chǎn)物。國內(nèi)外大量研究證實(shí)，MRPs能抑制香蕉、蘑菇等果蔬的酶促褐變[3]。目前，將MRPs用于蘑菇酪氨酸酶的抑制也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。Billaud等[3]研究經(jīng)優(yōu)化的谷胱甘肽-葡萄糖模式體系制備的MRPs對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制活性；Wu等[4]考察了不同類型還原糖（單糖、雙糖或低聚糖）對(duì)MRPs抑制蘑菇酪氨酸酶過程的影響，發(fā)現(xiàn)單糖影響效果優(yōu)于其他還原糖。本項(xiàng)目組前期開展了反應(yīng)條件[5]、超濾[6]對(duì)果糖-賴氨酸MRPs抑制香蕉褐變的影響，利用果糖-賴氨酸MRPs結(jié)合物理場(chǎng)來控制香蕉汁的褐變并對(duì)其進(jìn)行溫和滅菌等[7]，研究發(fā)現(xiàn)果糖-賴氨酸模式MRPs及其富集組分對(duì)香蕉PPO具有很好的抑制活性。食品科研工作者開展酶學(xué)研究時(shí)，常選取來源于蘑菇的酪氨酸酶作為模式酶類。然而，尚未見關(guān)于果糖-賴氨酸模式MRPs對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制方面的研究報(bào)道?；谙憬禤PO與酪氨酸酶結(jié)構(gòu)的相似性，以及不同模式MRPs在抑制機(jī)制方面存在著較多的共性特征，如螯合酶蛋白中的Cu2+與酶分子的可逆結(jié)合等，筆者推測(cè)果糖-賴氨酸MRPs對(duì)蘑菇酪氨酸酶也有較好的抑制效果。通常來講，MRPs的組分組成與反應(yīng)溫度、時(shí)間、初始pH值、底物濃度及比例等關(guān)系密切[4]?；诖?，本研究以果糖、賴氨酸為反應(yīng)底物，以酶活殘存率為響應(yīng)值，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用二次回歸中心組合（CCD）試驗(yàn)優(yōu)化MRPs制備條件，以期建立可預(yù)測(cè)最佳制備條件的數(shù)學(xué)模型。本研究對(duì)蘑菇采后酶促褐變的抑制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 賴氨酸、果糖、蘑菇酪氨酸酶、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、L-多巴胺、磷酸氫二鈉、濃磷酸、等，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 CR-22G冷凍高速離心機(jī)（日本HITACHI公司）；4836 controller PARR 5500壓力反應(yīng)釜（美國Parr公司）；Alpha-4冷凍干燥機(jī)（德國Matrin Christ 公司）；UV-2300紫外分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 MRPs的制備 MRPS制備參照周婭等[6]報(bào)道的方法略作調(diào)整，配制濃度均為1 mol/L的賴氨酸與果糖溶液，然后將2種溶液以一定體積比混合，用4 mol/L的NaOH或濃磷酸溶液調(diào)節(jié)混合液的pH值，再將混合液置于壓力反應(yīng)釜中，于不同的反應(yīng)溫度或時(shí)間條件下制備MRPs；待反應(yīng)結(jié)束，立即將反應(yīng)產(chǎn)物放置于冰水中冷卻，將冷卻后的MRPs凍成干粉儲(chǔ)藏備用。

1.2.2 MRPs對(duì)酪氨酸酶抑制能力的測(cè)定 將蘑菇酪氨酸酶與pH6.8的磷酸緩沖溶液按照質(zhì)量（g）與體積（mL）之比為1 ∶ 4的比例混合均勻，即為試驗(yàn)酶液。蘑菇酪氨酸酶活力測(cè)定試驗(yàn)參照 Shukla等[8]、Fatiha等[9]報(bào)道的方法略作調(diào)整，取1 mL 0.1%的MRPs溶液，加入2 mL 0.175 mol/L的磷酸緩沖液（pH6.8）和0.8 mL 0.01 mol/L的L-多巴胺溶液，混勻，將混合液置于30 ℃中水浴10 min，再加入制備好的酶液0.8 mL；加入酶液后開始計(jì)時(shí)，并在475 nm處測(cè)定其吸光度，每隔1 min測(cè)定1次，共6次，每個(gè)樣液重復(fù)3次。酶活性以1min內(nèi)OD值每增加0.001為一個(gè)活性單位（U），設(shè)加入樣品后酶活為V1，空白組不添加MRPs溶液，測(cè)定酶活為V0，酪氨酸酶活殘存率R=V1/V0×100%。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過單因素試驗(yàn)確定初始pH（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)溫度（C）、濃度比（D）對(duì)酪氨酸酶活殘存率（R）的影響。在此基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)4因素5水平二次回歸中心組合試驗(yàn)，以酪氨酸酶活殘存率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素和水平見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 美拉德反應(yīng)條件對(duì)MRPs抑制酪氨酸酶活性的影響

底物及濃度比對(duì)MRPs抑制酪氨酸酶活性的影響見圖1-a。任意總濃度時(shí)，隨果糖與賴氨酸濃度比的增大，酪氨酸酶活殘存率先減小后增大。濃度比2/1時(shí)，酶活殘余率最小。底物比一定時(shí)，總濃度越大，酶活殘余率越低。

pH的影響見圖1-b。pH<3時(shí)，酶活殘存率隨pH值增大而減小；pH=3～9時(shí)，酶活殘存率隨pH值增大而增大，pH=3時(shí)，酶活殘存率低于25%；pH=9～11時(shí)，酶活殘存率隨pH值增大而減小，但酶活殘余率均高于75%。

溫度的影響見圖1-c。100～110 ℃時(shí)，酶活殘存率隨溫度升高而減??；110～140 ℃時(shí)，酶活殘存率隨溫度升高而增大；大于140 ℃時(shí)，隨溫度升高酶活殘存率呈下降趨勢(shì)。

美拉德產(chǎn)物的酶抑制活性不僅受濃度、pH值、溫度的影響，還與加熱時(shí)間有很大關(guān)系。本研究中，時(shí)間的影響見圖1-d。隨時(shí)間延長，酶活殘存率先下降后升高。

綜上所述，單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，較優(yōu)的反應(yīng)條件為：底物濃度比為2 ∶ 1，pH為3，反應(yīng)溫度為110 ℃，反應(yīng)時(shí)間為1.5 h。

2.2 美拉德反應(yīng)條件的響應(yīng)曲面優(yōu)化

表2為不同試驗(yàn)條件下所測(cè)定的蘑菇酪氨酸酶活殘存率，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)酪氨酸酶活殘存率進(jìn)行回歸分析。

2.3 模型建立與分析

利用軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到數(shù)學(xué)模型如下：

Y=14.58-1.44A-5.92B-1.62C-4.45D+5.13AB-3.21AC-0.24AD+0.29BC-3.86BD-1.09CD+6.52A2+4.95B2+7.72C2+5.52D2。方差分析顯示，模型極顯著且失擬項(xiàng)不顯著（表3）。上述結(jié)果表明該方程擬合度較好，試驗(yàn)誤差小，試驗(yàn)范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)酶活殘存率。此外，一次項(xiàng)A（初始pH）、B（反應(yīng)時(shí)間）對(duì)酪氨酸酶活殘存率的線性效應(yīng)顯著，其他因素不顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2和D2對(duì)酪氨酸酶活殘存率的曲面效應(yīng)極顯著，交互項(xiàng)AB、AD交互效應(yīng)顯著，其他交互作用不顯著。因此，該模型的最佳反應(yīng)條件為：初始pH2.94，反應(yīng)時(shí)間1.9 h，反應(yīng)溫度110.09 ℃，底物濃度比（糖 ∶ 氨基酸）0.57，此時(shí)酪氨酸酶酶活殘存率為10.23%。

2.4 響應(yīng)面圖與等高線圖分析

固定2因素于零水平，其他因素的交互效應(yīng)見響應(yīng)曲面圖及等高線圖（圖2）。由表3可以看出，各因素對(duì)MRPs抑制酪氨酸酶活能力影響大小的排序如下：初始pH>反應(yīng)時(shí)間>反應(yīng)溫度>濃度比。等高線的形狀可反映自變量間交互效應(yīng)的顯著性，橢圓形表示2因素交互效應(yīng)顯著，圓形則反之[10]。結(jié)合圖2-a～f與表3的方差分析結(jié)果，反應(yīng)初始pH值（A）與反應(yīng)時(shí)間（B）的交互效應(yīng)顯著，反應(yīng)初始pH值（A）與底物濃度比（D）交互效應(yīng)顯著。

3 討論與結(jié)論

蘑菇采后褐變嚴(yán)重制約其貨架期。蘑菇酪氨酸酶是多酚氧化酶的一種，該酶對(duì)蘑菇酶促褐變起關(guān)鍵作用。MRPs具有抑制蘑菇酶促褐變的作用[3]，MRPs中的蛋白黑素、還原酮以及一些含N、S的雜環(huán)化合物等具有抗氧化、螯合銅離子、抑制酶活等特性，上述特性在抑制蘑菇酶促褐變中起重要作用[11]。而MRPs對(duì)蘑菇酪氨酸酶的活性抑制是衡量其抑制酶促褐變能力的重要指標(biāo)。

以果糖-賴氨酸為底物，本研究首先揭示了美拉德反應(yīng)條件（包括底物濃度和比例、pH、溫度、時(shí)間）對(duì)MRPs抑制蘑菇酪氨酸酶活性的影響。當(dāng)果糖與賴氨酸比例為2/1時(shí)，產(chǎn)物活性最高。Gu等[12]、趙晶等[13]指出，氨基與羰基比例為1 ∶ 2時(shí)有利于反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)氨基酸濃度過量時(shí)，分子內(nèi)氨基和羧基會(huì)形成內(nèi)酰胺，從而降低參與美拉德反應(yīng)的氨基的物質(zhì)量。Billaud等[14]考察了葡萄糖-半胱氨酸MRPs對(duì)蘋果PPO的抑制，發(fā)現(xiàn)初始pH<6時(shí)抑制作用明顯，pH為2～4時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的PPO抑制能力，該結(jié)論與本研究得出的結(jié)論（果糖-賴氨酸MRPs在初始pH為2-4時(shí)對(duì)蘑菇酪氨酸酶具有較強(qiáng)的抑制活性，在pH=3時(shí)對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制能力最強(qiáng)）基本一致。溫度是影響美拉德反應(yīng)的一個(gè)重要因素，溫度升高有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，但溫度過高時(shí)不利于MRPs的穩(wěn)定，從而影響MRPs的酶活抑制能力，這與Lan等[15]、周向軍等[16]的研究結(jié)果基本一致。隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的延長，MRPs組成組分發(fā)生變化，其對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制活性先增強(qiáng)后減弱。

基于較優(yōu)的單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過響應(yīng)曲面法對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并構(gòu)建相應(yīng)模型。本研究得到的最優(yōu)條件如下：底物濃度比（糖 ∶ 氨基酸）0.57，pH2.94，反應(yīng)時(shí)間1.9 h，反應(yīng)溫度110.09 ℃，此時(shí)蘑菇酪氨酸酶活殘存率為10.23%。Billaud等[3]在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了2因素5水平的二次回歸中心組合試驗(yàn)，考察葡萄糖-谷胱甘肽MRPs對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的抑制，確定最優(yōu)反應(yīng)條件如下：葡萄糖濃度為0.8～1.0 mol/L，谷胱甘肽濃度為0.15～0.5 mol/L，pH接近3，于110 ℃中反應(yīng)7 h，此時(shí)酶活殘存率約為25%。綜上所述的2個(gè)不同的反應(yīng)體系，都以對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的抑制為同樣的考察指標(biāo)，通過對(duì)比最優(yōu)條件可發(fā)現(xiàn)，兩者的初始pH及反應(yīng)溫度比較接近，而底物濃度及反應(yīng)時(shí)間則差別較大；就2個(gè)體系最優(yōu)反應(yīng)條件而言，本研究中的果糖-賴氨酸模式MRPs對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制活性要高于文獻(xiàn)[3]報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明針對(duì)不同模式底物開展反應(yīng)條件優(yōu)化的必要性。同時(shí)，上述結(jié)果也進(jìn)一步說明，因美拉德反應(yīng)組分的復(fù)雜性，反應(yīng)條件與美拉德產(chǎn)物組成組分及其活性間具有極其緊密的聯(lián)系。

然而，到目前為止，關(guān)于對(duì)酶促褐變起抑制作用的MRPs具體成分（包括其他模型體系）及其分子作用機(jī)理尚未見報(bào)道，這也正是筆者正在開展的研究?jī)?nèi)容。

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