謝鑫鑫 吳衛(wèi)東 林碧英 林忠平 高山 錢昆

摘 要 枸橘（Ponarus trifoliata）是一類含植物氣味成分較高的植物。從枸橘中分離氣味物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因—脂氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase， HPL）基因，并構(gòu)建35S啟動子驅(qū)動下的表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將其導(dǎo)入生菜中，經(jīng)PCR和Southern雜交檢測。結(jié)果顯示：有數(shù)十個陽性植株，且經(jīng)RT-PCR和Northern雜交鑒定HPL基因可在生菜中正常轉(zhuǎn)錄。

關(guān)鍵詞 脂氫過氧化物裂解酶基因；生菜；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號 S636.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Ponarus trifoliata is a kind of plant with higher plant odor components. The key hydroperoxide lyase（HPL） gene encoding odorants synthesis was isolated from P. trifoliate， and the expression vector driven by 35S promoter was constructed， then was transferred into lettuce by Agrobacterium-mediated method. PCR and Southern blot showed dozens of strain had positive hybridization signals， RT-PCR and Northern blot showed that the HPL gene could be transcribed normally in the plant of lettuce.

Key words Hydroperoxide Lyase（HPL）gene； Lettuce； Genetic transformation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.002

脂氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）是一類血紅素——鐵硫蛋白，屬于細(xì)胞色素P450（CytP450）類蛋白家族[1-3]，具有CytP450家族的普遍特征[4]。參與植物體內(nèi)脂氧化途徑，是脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）下游的一個關(guān)鍵性酶，能催化脂氫過氧化物裂解產(chǎn)生短鏈的揮發(fā)性醛及相應(yīng)的醇[5]，具有芬芳?xì)馕?，是形成植物特異性氣味的主要成分之一，被廣泛用于食品和香水的添加劑，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。同時還與植物抗病蟲、傷害、貯藏、老化等生理進(jìn)程有關(guān)[6-13]。當(dāng)植物受到病原菌侵染等生物脅迫或機械損傷等非生物脅迫時，植株HPL酶活性得到激活，通過LOX-HPL代謝途徑生成綠葉揮發(fā)物產(chǎn)生防御反應(yīng)[3，14-18]。

生菜（Lactuca sativa）營養(yǎng)豐富、鮮嫩爽口，是中國最受歡迎的生食綠葉蔬菜之一。然而，長期以來，人們對果蔬的研究主要集中在產(chǎn)量和抗性等方面，而作為果蔬的一個重要品質(zhì)指標(biāo)——香氣，其遺傳改良一直以來不被人們所重視。鑒于此，本研究從氣味比較強的蕓香科植物枸橘（Poncirus trifoliata）克隆HPL基因，構(gòu)建表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌后侵染生菜葉盤，獲得轉(zhuǎn)基因植株，以期提高其風(fēng)味，改善品質(zhì)，提高植株自身抗逆性和社會經(jīng)濟(jì)價值，為進(jìn)一步應(yīng)用基因工程技術(shù)改良生菜品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 枸橘（Poncirus trifoliata）葉片采于中國科學(xué)院植物所香山植物園；生菜所用品種為‘美國大速生，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 pMD18-T Vector購自TaKaRa公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、 TOP10、 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）Agl0、LBA4404和質(zhì)粒pCAMBIA3300-35S-Tnos、pCAMBIA

2300均由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林忠平實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI上已知的金柑瑪利亞HPL基因的相似序列，設(shè)計包括HPL基因起始密碼子、終止密碼子及相應(yīng)酶切位點在內(nèi)的1對引物，上游引物HPL-Sma Ⅰ-5′：TCCCCCGGGGGA

ATGAATGCCTCCATGATGATGATA（含SmaⅠ酶切位點），下游引物HPL-Kpn Ⅰ-3′：GGGGTACCC

CTCACTTGGCCTTTTCAACGG（含Kpn Ⅰ酶切位點）。設(shè)計用于檢測轉(zhuǎn)基因生菜的1對引物，上游引物HPL（枸橘）5′：ATGAATGCCTCCATGATGATG

ATA，下游引物HPL（枸橘）3′：TCACTTGGCCTTT

TCAACGG。所有引物合成及DNA測序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.2 pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos植物表達(dá)載體的構(gòu)建 （1）通過引物設(shè)計在HPL基因兩端引入酶切位點SmaⅠ和KpnⅠ，用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和KpnⅠ雙酶切質(zhì)粒 pCAMBIA3300-35S-Tnos，回收載體大片段pCAMBIA3300-35S，將HPL基因片段插入pCAMBIA3300-35S的SmaⅠ和KpnⅠ酶切位點間，得到中間載體pCAMBIA3300-35S-HPL；（2）用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA3300-35S-Tnos和質(zhì)粒pCAMBIA

2300，回收1 157 bp左右基因片段35S-Tnos和大片段pCAMBIA2300，將35S-Tnos片段插入pCAMBIA2300的HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點間，得到pCAMBIA2300-35S-Tnos載體；（3）用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和KpnⅠ雙酶切上述試驗獲得的中間載體質(zhì)粒pCAMBIA3300-35S-HPL和質(zhì)粒pCAMBIA2300-35S-Tnos，回收2 376 bp左右的基因片段和pCAMBIA2300-Tnos大片段，將含回收到的2 300 bp左右的基因片段插入pCAMBIA2300-Tnos的HindⅢ和KpnⅠ酶切位點間，得到目的表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos（圖1）。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的生菜遺傳轉(zhuǎn)化 （1）生菜組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基及條件。植物基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，pH=5.8，固體培養(yǎng)基含有0.8%瓊脂。生菜組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基：共培養(yǎng)培養(yǎng)基SM1，MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA；再生培養(yǎng)基SM2，MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+500 mg/L Cb；篩選培養(yǎng)基SM3，MS+0.05 mg/L NAA+45 mg/L Kan+500 mg/L Cb；生根培養(yǎng)基SM4，MS+0.05 mg/L NAA。培養(yǎng)條件：光培養(yǎng)14 h/d，暗培養(yǎng)10 h/d，培養(yǎng)溫度為23～28 ℃，光強為 1 200～1 400 lx 。

（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化葉盤：①分別接種農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子LBA4404和Agl0至20 mL的LB液體培養(yǎng)基（含Sm 100 mg/L、Rif 50 mg/L、Kan 100 mg/L）中，于28 ℃，190 r/min振蕩培養(yǎng)36～48 h，期間活化2次；②按照1 ∶ 5的比例將菌液分別稀釋至30 mL MS液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，190 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6；③取長勢健壯的生菜無菌組培苗的葉片，用剪刀剪成小塊，放入農(nóng)桿菌菌液中侵染10～15 min，期間不斷輕搖幾次充分侵染；④取出侵染好的小葉塊，用滅過菌的干凈濾紙吸干殘留菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基SM1中，28 ℃暗培養(yǎng)48 h；⑤共培養(yǎng)后，將葉片轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基SM2中，28 ℃光照培養(yǎng)，使其形成愈傷組織，并分化出芽；⑥待芽長至2～3 cm時剪下，轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基SM3中，并對其進(jìn)行Kan抗性篩選，篩選后再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基SM4中誘導(dǎo)生根。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的檢測 （1）DNA提取及PCR檢測：采用廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取生菜抗性植株和未轉(zhuǎn)基因植株葉片的基因組DNA，以未轉(zhuǎn)基因植株葉片的基因組DNA為對照，以HPL（枸橘）5′和HPL（枸橘）3′為引物進(jìn)行PCR檢測。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保溫10 min，降至4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

（2）Southern印跡雜交鑒定：采用Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ試劑盒。隨機選擇PCR檢測為陽性的8個株系進(jìn)行Southern印跡雜交鑒定，用內(nèi)切酶HindⅢ消化這8個株系的DNA。DNA酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠60 V恒壓下電泳4～6 h后，進(jìn)行Southern雜交。

（3）RT-PCR檢測：采用Trizol法提取上述鑒定呈陽性的生菜植株總RNA，用Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，以cDNA為模板，以HPL（枸橘）5′和HPL（枸橘）3′為引物，進(jìn)行PCR檢測。

（4）Northern雜交檢測：采用Trizol法提取上述鑒定呈陽性的生菜植株總RNA，取10 μL（約20 μg）甲酰胺溶解的RNA樣品，依次加入5×MOPS 2 μL、甲醛3.5 μL、甲酰胺3.5 μL，充分混勻后，65 ℃水浴15 min，轉(zhuǎn)至冰上冷卻，稍離心后，加入2 μL 6×loading buffer，于50～60 V的甲醛凝膠電泳4～6 h，最后進(jìn)行Northern雜交。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPL基因的克隆及序列分析

以HPL-SmaⅠ-5′和HPL-KpnⅠ-3′為上、下游引物，以枸橘總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，通過PCR 擴增反應(yīng)，得到一條1 500 bp左右的基因片段（圖2），回收、連接并轉(zhuǎn)化，再經(jīng)抗生素篩選及菌液PCR 篩選陽性克隆，選取具有目的條帶的2號菌液測序。

測序結(jié)果經(jīng)www.ncbi.nlm.nlh.gov網(wǎng)站中的BLAST分析，結(jié)果表明，HPL基因在蕓香科植物中表現(xiàn)出了較高的同源性。從枸橘中所克隆的HPL基因序列與金柑瑪格麗塔HPL基因序列（GenBank：GU997105.1）的同源性為99.13%，與柑橘克萊門基因序列的同源性為99%（GenBank：XM_006447537.1），與甜橙HPL基因序列的同源性為98.8%（GenBank：NM_001288924.1），

2.2 植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos的構(gòu)建

提取重組質(zhì)粒pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos并分析其酶切位點，選用KpnⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切，結(jié)果顯示，酶切片段的大小與克隆的HPL基因相符，表明目的基因HPL已經(jīng)成功克隆至表達(dá)載體上，成功構(gòu)建了表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos。

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的生菜遺傳轉(zhuǎn)化

將凍融法轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌LBA4404和Agl0轉(zhuǎn)化子在固體LB（含100 mg/L Kan、50 mg/L Rif以及100 mg/L Sm）平板上進(jìn)行篩選鑒定，結(jié)果顯示，表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404和Agl0中。根癌農(nóng)桿菌侵染生菜植株葉片后，于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d后，轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基上25～30 d，誘導(dǎo)分化出小苗，在含Kan的篩選培養(yǎng)基中初步篩選出長勢健壯的植株進(jìn)行下一步檢測。

2.4 轉(zhuǎn)基因生菜的檢測

2.4.1 PCR鑒定 以抗性植株總DNA為模板，未轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照，表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos質(zhì)粒作為陽性對照，ddH2O為負(fù)對照，分別在農(nóng)桿菌LBA4404和Agl0侵染的抗性株系中隨機選取48株，用HPL基因引物進(jìn)行PCR擴增鑒定。結(jié)果表明，在48株抗性株系中，農(nóng)桿菌LBA4404和Agl0侵染的陽性植株分別為31株和26株（圖3，部分株系）。

2.4.2 Southern 印記雜交鑒定 用Southern雜交進(jìn)一步驗證PCR呈陽性株系，提取長勢良好的陽性植株總DNA，用探針序列內(nèi)沒有的酶切位點HindⅢ進(jìn)行消化（圖4，部分株系），以非轉(zhuǎn)基因植株DNA為陰性對照，進(jìn)行雜交。分析結(jié)果顯示，陽性植株均出現(xiàn)1 500 bp的雜交條帶，而非轉(zhuǎn)基因植株則沒有，與PCR結(jié)果一致，這說明外源基因已經(jīng)成功導(dǎo)入植株中（圖5，部分株系）。

2.4.3 轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR鑒定 轉(zhuǎn)基因生菜在基因組水平對HPL基因進(jìn)行鑒定后（PCR鑒定和Southern雜交），在轉(zhuǎn)錄水平上再用RT-PCR方法對HPL基因進(jìn)行鑒定，檢測外源HPL基因是否表達(dá)，對上述PCR鑒定呈陽性的植株進(jìn)行總RNA的提取，用oligo dT作逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行PCR，結(jié)果見圖6。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中均能擴增出長約1.5 kb的HPL特異條帶，而非轉(zhuǎn)基因植株中的cDNA模板則未克隆出該條帶。

2.4.4 轉(zhuǎn)基因植株Northern鑒定 通過Northern 雜交進(jìn)一步確定外源基因的表達(dá)，選取上述鑒定出的陽性植株，提取植株的總RNA，以非轉(zhuǎn)基因植株的RNA為陰性對照，進(jìn)一步分析HPL基因在植株中的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明，外源基因能夠正常轉(zhuǎn)錄，而非轉(zhuǎn)基因植株則未雜交出目的條帶，這與RT-PCR結(jié)果一致（圖7，部分株系）。

3 討論與結(jié)論

HPL是植物脂氧化途徑中脂氧合酶下游反應(yīng)的關(guān)鍵酶，其催化產(chǎn)生醛或醇，不僅是果蔬特異性氣味的重要組成部分，還與植物抗病蟲、抗真菌及傷害反應(yīng)有關(guān)[4，19-20]。通過基因工程手段將HPL基因轉(zhuǎn)化到蔬菜中，有利于提高蔬菜的香氣和自身抗逆性，對蔬菜品質(zhì)改良具有重要意義。自1996年來自甜椒的第一個HPL基因完成克隆以來[1]，與此酶的相關(guān)研究逐漸受到人們重視。趙凌等[9]曾對植物HPL的生化特性和功能做過比較全面的評述，指出HPL的催化產(chǎn)物不僅是植物特異性氣味的重要組成部分，同時也與植物的抗病蟲性相關(guān)。Matsui等[8]的研究結(jié)果也顯示HPL誘導(dǎo)物招引害蟲的天敵也是一種間接的抗蟲作用。Engelberth[10]等的研究結(jié)果表明通過某些化合物激發(fā)GLVs信號可達(dá)到抑制蟲害的效果，可為新型農(nóng)藥的開發(fā)鋪平道路。Ninkovic等[11]利用這方面的研究成果在抑制蚜蟲對馬鈴薯的危害方面取得了一定的成果，中國農(nóng)科院茶葉所將茶葉中的HPL基因?qū)敕扬@著強化了番茄對病蟲害的防御能力[12]。

在農(nóng)桿菌菌株選擇中，農(nóng)桿菌菌株的侵染轉(zhuǎn)化率在應(yīng)用于不同植株時也有很大的差異，每種植株都存在其最適宜或最敏感的農(nóng)桿菌菌株[21]。本研究使用2個不同農(nóng)桿菌菌株（Agl0和LBA4404）侵染生菜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，分別從侵染的抗性株系中隨機選取48株，對其進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明不同農(nóng)桿菌菌株的轉(zhuǎn)化率不同，從農(nóng)桿菌菌株Agl0篩選出26株陽性植株，從LBA4404篩選出31株陽性植株，轉(zhuǎn)化率分別為54.2%（Agl0）和64.6%（LBA4404）。因此，農(nóng)桿菌LBA4404菌株更適合作為生菜的遺傳轉(zhuǎn)化。

經(jīng)過Kan篩選及多次PCR檢測，初步證實了目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到植株中，然而，考慮到PCR可能受某些因素的影響造成假陽性，因此隨機抽取6株P(guān)CR鑒定為陽性的生菜植株進(jìn)行Southern雜交檢測，結(jié)果6株生菜均為轉(zhuǎn)基因株系，這表明外源基因HPL已經(jīng)成功導(dǎo)入生菜植株中。為了進(jìn)一步檢測外源基因HPL能否在植物中正常表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平上對上述陽性植株又進(jìn)行了RT-PCR和Northern雜交檢測，結(jié)果顯示，外源基因HPL在生菜中能夠正常轉(zhuǎn)錄。

本研究從氣味較強的蕓香科植物枸橘中克隆得到HPL基因，并構(gòu)建表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將HPL基因?qū)肷?，并進(jìn)行Kan篩選及多次PCR檢測、Southern雜交檢測、RT-PCR和Northern雜交檢測獲得轉(zhuǎn)基因生菜，進(jìn)一步的工作是將獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行田間試驗，檢測HPL基因表達(dá)效果，并進(jìn)行抗性試驗，觀察農(nóng)藝性狀、腺毛、氣味成分的變化，同時進(jìn)行后代遺傳特性等研究。

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