楊菲穎 申艷紅 耿姣姣 吳用 李科 陳曉靜

摘要 為探究番木瓜NAC轉(zhuǎn)錄因子的序列特征及功能，以‘大慶7號番木瓜果肉為試驗材料，采用RT-PCR克隆出2個不同的NAC類基因，命名為CpNAC1（GeneBank KT364871）和CpNAC2（GeneBank KT372241），其開放閱讀框（ORF）長度分別為609bp和805bp，分別編碼202個和268個氨基酸，其N端含有NAM保守結(jié)構(gòu)域。采用實時熒光定量PCR研究其在乙烯利及清水對照處理后果實不同成熟時期中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CpNAC1和CpNAC2基因隨著處理后時間的增加，表達(dá)量呈先下降后緩慢上升的趨勢，且均與果實成熟呈負(fù)相關(guān)。但CpNAC1表達(dá)趨勢與果實成熟過程中乙烯的表達(dá)量相反，受乙烯抑制降低表達(dá)量，從而參與了番木瓜果實的成熟衰老進(jìn)程，而CpNAC2基因在乙烯處理后番木瓜果實中表達(dá)量與對照處理相比沒有顯著變化，說明CpNAC2基因不是通過乙烯信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)控果實成熟。

關(guān)鍵詞 番木瓜；NAC轉(zhuǎn)錄因子；基因克隆；果實成熟

中圖分類號 S667.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract In the present study， two novel NAC genes encoding NAC proteins in papaya， CpNAC1 and CpNAC2 were isolated from papaya fruit. The length of the cDNAs of CpNAC1 and CpNAC2 was 609 bp and 805 bp， encoding 202 and 268 predicted amino acids， respectively. Sequence analysis demonstrated that the CpNAC1 and CpNAC2 proteins contained NAM consecutive structural domain of the NAC superfamily. RT-qPCR analysis demonstrated that the expressing level of CpNAC1 and CpNAC2 dropped first and slowly increased afterward， and was negatively correlated with fruit mature. But the expression of CpNAC1 decreased significantly after ethephon treatment， indicating that CpNAC1 may be related to ethylene signal tansduction pathway. And CpNAC2 transcript levels had no change during ethephon treatment compared to the controls. These results suggests that the expression of CpNAC2 decrease in papaya fruit ripening and softening was not induced by ethylene.

Key words Papaya； NAC transcription factor； Gene cloning； Fruit ripening

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.008

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）轉(zhuǎn)錄因子是近年發(fā)現(xiàn)最大的具有多種功能的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子。其蛋白最顯著的結(jié)構(gòu)特點是N端含有150個氨基酸殘基組成的高度保守結(jié)構(gòu)域，C端為高度變異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，具有轉(zhuǎn)錄激活或抑制活性。研究結(jié)果表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在植物的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，包括頂端分生組織的形成，植物形態(tài)建成，葉片衰老，胚胎發(fā)育，類黃酮生物合成，側(cè)根的發(fā)育，次生細(xì)胞壁的形成。此外一些研究報道，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與激素信號傳導(dǎo)，包括生長素、乙烯、脫落酸、赤霉素、水楊酸和細(xì)胞分裂素等。而且也參與植物對病原菌、真菌等生物的侵染以及干旱、低溫、高鹽、機(jī)械損傷等非生物逆境的抗逆反應(yīng)。

近年來，NAC轉(zhuǎn)錄因子在果實衰老過程中的調(diào)控作用被廣泛地研究。Kou等研究發(fā)現(xiàn)，AtNAP基因?qū)M南芥長角果的衰老過程具有促進(jìn)作用。Ma經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，番茄SlNAC1基因通過負(fù)調(diào)控乙烯的合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)番茄果實的著色，通過正調(diào)控ABA合成調(diào)節(jié)番茄果實成熟。Shan等研究發(fā)現(xiàn)，香蕉MaNAC1/2影響乙烯信號途徑中下游基因EIN-3的表達(dá)，預(yù)測可能通過調(diào)節(jié)乙烯信號途徑參與香蕉果實的衰老過程。番木瓜作為具有重要經(jīng)濟(jì)價值的果樹模式植物，屬呼吸躍變型果實且對低溫敏感，不利于運輸和貯藏，由于NAC轉(zhuǎn)錄因子具有降低乙烯信號傳導(dǎo)途徑，從而延緩果實衰老的功能，目前尚未見到有關(guān)番木瓜NAC轉(zhuǎn)錄因子的報道，因此，有必要探索番木瓜中NAC轉(zhuǎn)錄因子在果實衰老過程的調(diào)控機(jī)制。本試驗以番木瓜為材料，根據(jù)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB中推測的番木瓜NAC轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，利用RT-PCR等技術(shù)克隆NAC基因并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析，以期探明NAC在番木瓜果實成熟軟化中的功能，為耐貯運，長貨架期的番木瓜分子育種提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料及菌種 選擇表面完好、無機(jī)械損傷、大小均勻一致的綠熟期‘大慶7號番木瓜果實為試驗材料，在25℃進(jìn)行乙烯利及清水對照處理，將果實分別用0.5g/L的乙烯利水溶液和清水浸泡3min，自然晾干后，用體積為62.5cm3的泡沫箱裝箱密封2h，處理后將果實放在25℃房中儲藏。將處理后6、12、24h和3d的番木瓜果實去除果皮和種子，果肉切成2mm×2mm×2mm的塊狀，用液氮速凍后于-80℃貯存?zhèn)溆谩４竽c桿菌菌株DH5a為本實驗室保存。

1.1.2試劑 ExTaq、dNTPs、18-T載體購自TaKaRa公司，瓊脂糖膠回收試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit購自BD Biosciences Clontech公司，通用RNA提取試劑盒R1051、SYBR ExScript試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 使用東盛生物通用RNA提取試劑盒R1051提取番木瓜果肉RNA，并利用紫外分光光度計Q-5000和瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度后，參照Super SMART PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書，以番木瓜果肉RNA（200ng）為模板合成雙鏈cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR引物的設(shè)計與合成 利用植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB（plant transcription Factor Database）plantffdb.cbi.pku.edu.cn/index.php）]，得到推測的番木瓜（Carica papaya）NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的82個氨基酸序列，利用NCBI中的tBlastn工具獲得番木瓜82個轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列。利用Primer5.0在開放閱讀框的兩側(cè)設(shè)計特異引物（見表1）。引物合成及基因測序工作均由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3番木瓜NAC基因cDNA克隆 以‘大慶7號番木瓜果肉cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25μL體系。PCR反應(yīng)程序為：94℃3min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，35次循環(huán)：72℃7min。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶割膠回收，連接18-T載體并轉(zhuǎn)化DH5a，菌液鑒定后測序。

1.2.4生物信息學(xué)分析 利用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計：利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接和蛋白質(zhì)翻譯：Blastn和Blastx（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行基因及蛋白質(zhì)同源性搜素：使用Swissport（http：//www.expasy.ch/sprot/）和PFAM（http：//pfam.sanger.ac.uk/）進(jìn)行氨基酸序列結(jié)構(gòu)域分析：利用SignalP4.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）對氨基酸序列信號肽進(jìn)行預(yù)測：用SOPM法進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析：用Phyre2（id=index）進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析：用MEGA 6.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建分子進(jìn)化樹。

1.2.5NAC類基因的表達(dá)分析 提取500μg/L乙烯利和清水處理后6、12、24h和3d的番木瓜果肉RNA，將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA（500ng/L）稀釋3倍作為qRT-PCR的模板，以CpActin為內(nèi)參，qCpNAC1-F，R和qCpNAC1-F（R分別為2個NAC類基因的上下游引物）檢測NAC類基因在番木瓜不同成熟時期不同處理的表達(dá)水平，序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系為10μL體系：SYBR Mix 4μL，PCRforward primer（10mol/L）0.2μL，PCR Reverse primer（10mol/L）0.2μL，cDNA 1μL，ddH₂O 4.6μL，每個樣品4次重復(fù)。利用三步法擴(kuò)增程序：94℃3min，95℃15s，60℃30s，72℃20s。40次循環(huán)。將清水處理后6h的表達(dá)量作為相對參照。定義為1。采用2^-△△Ct法進(jìn)行相對表達(dá)量的分析，用SPSS19.0進(jìn)行鄧肯氏多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1番木瓜NAC類基因的克隆與序列分析

以番木瓜果肉cDNA為模板，擴(kuò)增獲得兩條條帶，與預(yù)期基因片段大小一致（圖1），挑陽性克隆送檢。測序結(jié)果顯示。2條基因的開放閱讀框（ORF）分別為609bp和805bp，共編碼202個和268個氨基酸。將2個基因分別命名為CpNAC1、CpNAC2，GenBank登錄號為KT364871、KT372241。

2.2番木瓜NAC的生物信息學(xué)分析

將CpNAC1、CpNAC2基因的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行CDD搜索（圖2），保守結(jié)構(gòu)域分析表明，CpNAC1的N端8～138位氨基酸、CpNAC2的N端26～117位氨基酸，都為NAM保守結(jié)構(gòu)域。利用DNAMAN6.0軟件將基因CpNAC1、CpNAC2開放閱讀框翻譯成氨基酸序列，進(jìn)行同源序列比對分析，CpNAC1同擬南芥Arabidopsis thaliana（NP_201258.2）、煙草Nicotiana tabacum（XP_009762857.1）、草莓Fragaria vesca subsp.（XP 004309284.1）、葡萄Vitis vinifera（XP_002264894.3）、甜橙Citrus sinensis（XP_006432173.1）、楊樹Populus trichocarpa（XP_002310519.1）的同源性分別為97%、99%、100%、100%、100%，CoNAC2同可可Theobroma cacao（XP_007017462.1）、麻瘋樹Jatropha curcas（XP_012071783.1）、蓖麻Ricinus communis（XP_002510344.1）的同源性分別為97%、98%、100%，說明NAC轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列高度保守。

為研究NAC的進(jìn)化關(guān)系，用MEGA6.0軟件構(gòu)建11種高等植物的NAC系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3所示，CpNAC1和CpNAC2分別屬于2個分支，與CpNAC1親緣關(guān)系最近的是草莓，同屬于草本果樹。CpNAC2與可可、蓖麻、麻瘋樹親緣關(guān)系較近。CpNAC1和CpNAC2都與單子葉植物水稻進(jìn)化距離相對較遠(yuǎn)。

2.3番木瓜NAC轉(zhuǎn)錄因子的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用Protparam等在線工具預(yù)測2種番木瓜NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白的基本理化性質(zhì)（表2），2種番木瓜NAC都屬于親水性和不穩(wěn)定性蛋白。經(jīng)跨膜螺旋分析，CpNAC1的跨膜螺旋數(shù)均為0，未形成跨膜區(qū)域，不是膜蛋白：CpNAC2在膜內(nèi)跨膜螺旋數(shù)為0，膜外跨膜螺旋數(shù)為1，即結(jié)合在膜外側(cè)，屬于膜蛋白，可能與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。2種番木瓜NAC蛋白不存在信號肽。為非分泌蛋白。通過SOPM法對2種番木瓜NAC轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果表明。CpNAC1由28.71%α-螺旋、16.83%延伸鏈、9.90%β-轉(zhuǎn)角和44.55%隨機(jī)卷曲組成。CpNAC2由27.24%α-螺旋、18.28%延伸鏈、10.45%β-轉(zhuǎn)角和44.03%隨機(jī)卷曲組成。

以Phyre2工具預(yù)測番木瓜2種NAC蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖4），可以看出α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和隨機(jī)卷曲的二級結(jié)構(gòu)為折疊方式。CpNAC1和CpNAC2兩蛋白具有相似的三級結(jié)構(gòu)，其中CpNAC1較CpNAC2多一個α-螺旋。

2.4CpNAC基因在番木瓜不同成熟時期的表達(dá)

試驗中觀察到乙烯利處理和清水處理24h后的番木瓜果實特征見圖5。從圖5可見，2個處理從果皮顏色上比較無顯著差異，都為綠色，但乙烯利處理的番木瓜24h開始軟化，果肉大面積變黃，而此時期清水處理的果肉仍然硬度較大，果肉顏色較淺。

應(yīng)用qRT-PCR法檢測CpNAC在番木瓜中乙烯利和清水對照處理后6、12、24h和3d果實中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖6所示，其中CpNAC1和CpNAC2隨著處理后時間的增加，表達(dá)量呈先下降后緩慢上升的趨勢，且表達(dá)量均低于6h的對照組，說明這2個轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與果實成熟呈負(fù)相關(guān)。其中，CpNAC1經(jīng)外源乙烯處理，在24h時表達(dá)量達(dá)到最低，顯著低于清水處理后該時期的表達(dá)量，表明該基因的轉(zhuǎn)錄水平受乙烯的負(fù)調(diào)控。CpNAC2表達(dá)量在處理后24h最低，不同時期外源乙烯處理的表達(dá)量與清水處理變化無顯著差異，說明該基因在果實成熟過程受乙烯調(diào)控不明顯。以上結(jié)果說明，CpNAC1表達(dá)趨勢與果實成熟過程中乙烯的表達(dá)量相反，受乙烯抑制降低表達(dá)量，從而參與了番木瓜果實的成熟衰老進(jìn)程，而CpNAC2基因在乙烯處理后番木瓜果實中表達(dá)量與對照處理相比沒有顯著變化，說明CpNAC2基因不是通過乙烯信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)控果實成熟。

3討論與結(jié)論

NAC作為最大的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族，在擬南芥和水稻中已有許多NAC類基因被克隆并鑒定出來，本試驗首次從番木瓜中分離出了2個NAC類基因CpNAC1，CpNAC2的全長cDNA。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分析，CpNAC1和CpNAC2轉(zhuǎn)錄因子的N端為高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域。本試驗結(jié)果豐富了番木瓜NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員及其遺傳背景。為后人的研究提供理論參考。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，CpNAC1和CpNAC2都與單子葉植物水稻進(jìn)化距離相對較遠(yuǎn)，CpNAC1與草莓親緣關(guān)系最近，CpNAC2與可可、蓖麻、麻瘋樹親緣關(guān)系較近。蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)較相似，但CpNAC1蛋白較CpNAC2蛋白多1個α-螺旋，該結(jié)構(gòu)的差異是否是導(dǎo)致兩蛋白功能差異的主要原因尚需進(jìn)一步研究證實。

果實衰老是一個復(fù)雜的生理生化過程，受到眾多基因和生物途徑調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。許多轉(zhuǎn)錄因子參與了果實衰老過程，如AP2、bZIP、MYB、WRKY、MADS、NAC等。在許多植物中發(fā)現(xiàn)，NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受到乙烯的誘導(dǎo)和抑制。番木瓜屬于典型的呼吸躍變型果實，在果實成熟起始會釋放大量的乙烯并且伴隨著呼吸速率的迅速增加。為深入了解番木瓜NAC的功能，筆者對番木瓜果實進(jìn)行了外源乙烯處理和清水處理后不同時間NAC類基因表達(dá)量檢測。結(jié)果說明，CpNAC1、CpNAC2伴隨果實衰老，表達(dá)量均低于6h的對照組，說明這2個轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)均與果實成熟呈負(fù)相關(guān)。Ma等研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SlNAC1抑制乙烯釋放，延緩果實衰老：Shan等研究中發(fā)現(xiàn)MaNAC1、MaNAC2在外源乙烯利的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄水平大大提升。而CpNAC1表達(dá)趨勢與果實成熟過程中乙烯的表達(dá)量相反，受乙烯抑制降低表達(dá)量，CpNAC2基因在乙烯處理后番木瓜果實中表達(dá)量與清水處理相比沒有顯著差異，借此推測，CpNAC1可能通過負(fù)調(diào)控乙烯的生物合成和信號傳導(dǎo)參與果實成熟衰老調(diào)控過程，CpNA C2基因不是通過乙烯信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)控果實成熟，具體的調(diào)控途徑還需從轉(zhuǎn)基因等方面進(jìn)一步研究。

本試驗從外源乙烯施加下基因的轉(zhuǎn)錄水平角度來初步預(yù)測CpNAC1、CpNAC2功能，為進(jìn)一步深入探討番木瓜成熟衰老期間轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制提供必要的理論參考，為耐貯運，長貨架期的番木瓜分子育種提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Olsen A N， Ernst H A， Lo Leggio L， et al. NAC transcription factors： structurally distinct， functionally diverse[J]. Trends in Plant Science， 2005， 10（2）： 79-87.

[2] Hibara K， Takada S， Tasaka M. CUC1 gene activates the expression of SAM～related genes to induce adventitious shoot formation[J]. Plant Journal， 2003， 36（5）： 687-96.

[3] Sablowski R W， Meyerowitz E M. A homolog of NO APICAL MERISTEM is an immediate target of the floral homeotic genes APETALA3/PISTILLATA[J]. Cell， 1998， 92（1）： 93-103.

[4] Guo Y F， Gan S S. AtNAP， a NAC family transcription factor， has an important role in leaf senescence[J]. Plant Journal， 2006， 46（4）： 601-612.

[5] Uauy C， Distelfeld A， Fahima T， et al. A NAC gene regulating senescence improves grain protein， zinc， and iron content in wheat[J]. Science， 2006， 314（5803）： 1 298-1 301.

[6] Larsson E， Sitbon F， Sundstrom J， et al. NAC regulation of embryo development in conifers[J]. BMC Proceedings， 2011， 5， 67.

[7] Morishita T， Kojima Y， Maruta T， et al. Arabidopsis NAC transcription factor， ANAC078， regulates flavonoid biosynthesis under high-light[J]. Plant and Cell Physiology， 2009， 50（12）： 2 210-2 222.

[8] Vroemen C W， Mordhorst A P， Albrecht C， et al. The CUP-SHAPED COTYLEDON3 gene is required for boundary and shoot meristem formation in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2003， 15（7）： 1 563-1 577.

[9] Zhong B， Yang Y， Li S， et al. The adaptor protein MITA links virus-sensing receptors to IRF3 transcription factor activation[J]. Immunity， 2008， 29（4）： 538-550.

[10] Xie Q， Frugis G， Colgan D， et al. Arabidopsis NAC1 transduces auxin signal downstream of TIR1 to promote lateral root development[J]. Genes & development， 2000， 14（23）： 3 024-3 036.

[11] He X J， Mu R L， Cao W H， et al. AtNAC2， a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways， is involved in salt stress response and lateral root development[J]. Plant Journal， 2005， 44（6）： 903-916.

[12] Yang S D， Seo P J， Yoon H K， et al. The Arabidopsis NAC transcription factor VNI2 integrates abscisic acid signals into leaf senescence via the COR/RD genes[J]. Plant Cell， 2011， 23（6）： 2 155-2 168.

[13] Han Q， Zhang J， Li H， et al. Identification and expression pattern of one stress-responsive NAC gene from Solanum lycopersicum[J]. Molecular Biology Reports， 2012， 39（2）： 1 713-1 720.

[14] Aida M， Ishida T， Fukaki H， et al. Genes involved in organ separation in Arabidopsis： an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J]. The Plant cell， 1997， 9（6）： 841-857.

[15] Wang X E， Basnayake B M ， Zhang H， et al. The Arabidopsis ATAF1， a NAC transcription factor， is a negative regulator of defense responses against necrotrophic fungal and bacterial pathogens[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2009， 22（10）： 1 227-1 238.

[16] Kim S Y， Kim S G， Kim Y S， et al. Exploring membrane-associated NAC transcription factors in Arabidopsis： implications for membrane biology in genome regulation[J]. Nucleic Acids Research， 2007， 35（1）： 203-213.

[17] Delessert C， Kazan K， Wilson I W， et al. The transcription factor ATAF2 represses the expression of pathogenesis-related genes in Arabidopsis[J]. Plant Journal， 2005， 43（5）： 745-757.

[18] Nakashima K， Zhou X， Kunkel G， et al. The novel zinc finger-containing transcription factor Osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation[J]. Cell， 2002， 108（1）： 17-29.

[19] Kou X， Watkins C B， Gan S S. Arabidopsis AtNAP regulates fruit senescence[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（17）： 6 139-6 147.

[20] Ma N， Feng H， Meng X， et al. Overexpression of tomato SlNAC1 transcription factor alters fruit pigmentation and softening[J]. Bmc Plant Biology， 2014， 14： 1 471-2 229.

[21] Shan W， Kuang J f， Chen L， et al. Molecular characterization of banana NAC transcription factors and their interactions with ethylene signalling component EIL during fruit ripening[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（14）： 5 171-5 187.