梁芳　張 繼　呂平　龍凌云　黃惠芳　檀小輝　韋麗君

摘要：【目的】發(fā)掘出一批玫瑰SNP候選位點(diǎn)，為進(jìn)一步開發(fā)玫瑰EST-SNP標(biāo)記及研究玫瑰遺傳背景、相關(guān)性狀的分子標(biāo)記等打下基礎(chǔ)?！痉椒ā繌拿绹?guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)下載27125條玫瑰EST序列，經(jīng)生物信息學(xué)方法分析，發(fā)掘玫瑰EST-SNP位點(diǎn)，并對(duì)其所在核苷酸序列進(jìn)行功能注釋分析?！窘Y(jié)果】對(duì)27125條EST進(jìn)行拼接，共得到3544條重疊群（Contigs），其中有243個(gè)Contigs含有SNP候選位點(diǎn)。從中篩選出224個(gè)候選EST-SNP位點(diǎn)，其堿基突變類型中轉(zhuǎn)換和顛換的數(shù)量分別占SNP候選位點(diǎn)總數(shù)的59.8%和27.2%。通過序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)有22個(gè)SNP位點(diǎn)來源于薔薇科植物（與玫瑰同科），其中來源于野草莓的基因最多（8個(gè)），另有15個(gè)SNP位點(diǎn)所在的EST序列與某些軟體動(dòng)物門物種的基因具有較高同源性。【結(jié)論】NCBI中的玫瑰EST數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)龐大，足夠發(fā)掘出大量的SNP標(biāo)記，使得以EST-SNP對(duì)薔薇科玫瑰等植物進(jìn)行品種鑒定、分類、遺傳多樣性分析具有可行性。

關(guān)鍵詞： 玫瑰；EST序列；SNP位點(diǎn)；生物信息學(xué)；NCBI

中圖分類號(hào)： S685.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）03-325-07

0 引言

【研究意義】玫瑰（Rosa rugosa）是薔薇科重要的觀賞植物，因其具有芳香且抗黑斑病、耐鹽堿等特性而成為薔薇科觀賞植物育種的重要資源（Von Malek et al.，2000；馮立國(guó)等，2008；于曉艷等，2009）。我國(guó)的玫瑰種質(zhì)資源豐富，但品種間的親緣關(guān)系混亂，給其品種鑒定、分類及品種權(quán)保護(hù)帶來很大困難，進(jìn)而制約了玫瑰育種進(jìn)程及其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此，對(duì)玫瑰進(jìn)行品種鑒定、分類、遺傳多樣性分析是玫瑰研究的當(dāng)務(wù)之急。發(fā)掘玫瑰單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）就是利用SNP對(duì)玫瑰進(jìn)行品種鑒定、分類及遺傳多樣性研究，可為玫瑰育種提供新途徑。【前人研究進(jìn)展】自Picoult-Newberg等（1999）首次以表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tags，EST）數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)發(fā)掘SNP位點(diǎn)以來，許多學(xué)者依照此法對(duì)不同物種進(jìn)行了大量研究，目前已在人類（Garg et al.，1999）、小鼠和大鼠（Guryev et al.，2004）、牛（Snelling et al.，2005）、豬（Kerstens et al.，2009）及水產(chǎn)（曾地剛等，2014）等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。近年來，EST-SNP標(biāo)記的開發(fā)在植物上也得到推廣應(yīng)用，如擬南芥（Torjék et al.，2003）、玉米（Batley et al.，2003）、水稻（Feltus et al.，2004）、松樹（Dantec et al.，2004）、番茄（Yamamoto et al.，2005）和大麥（Kota et al.，2008）等。在薔薇科植物中，多選擇對(duì)梅、桃、杏、枇杷等經(jīng)濟(jì)果樹進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化及遺傳多樣性等研究，如王?。?013）利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）中已公布枇杷基因的部分序列為模板設(shè)計(jì)引物，篩選出7對(duì)引物進(jìn)行基因克隆及同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明，在不同枇杷品種間存在豐富的SNP位點(diǎn)。張得芳等（2014）也利用EST資源庫(kù)下載相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，找到了EST- SNP位點(diǎn)在薔薇科薔薇屬、蘋果屬、梨屬、李屬、草莓屬和懸鉤子屬等6個(gè)屬間的分布規(guī)律和特點(diǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然關(guān)于EST-SNP位點(diǎn)開發(fā)的研究已有較多報(bào)道，但尚未發(fā)現(xiàn)在玫瑰中開發(fā)SNP標(biāo)記?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從NCBI的玫瑰EST數(shù)據(jù)庫(kù)下載大量EST數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法發(fā)掘出一批玫瑰SNP候選位點(diǎn)，以期為進(jìn)一步開發(fā)玫瑰EST-SNP標(biāo)記及研究玫瑰遺傳背景、相關(guān)性狀的分子標(biāo)記等打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 玫瑰EST獲得及多序列聚類簇分析

從NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/？term=rose）下載27125條玫瑰EST序列，所有EST序列均以FASTA格式保存。利用DNASTAR 7.1.0（44.1）軟件包中的SeqMan程序?qū)ο螺d的玫瑰EST序列進(jìn)行聚類，屬于同一個(gè)基因的EST聚類為1個(gè)Cluster，并對(duì)其進(jìn)行序列拼接得到重疊群（Contigs）。

1. 2 玫瑰EST-SNP位點(diǎn)篩選及分析

玫瑰EST-SNP位點(diǎn)篩選用DNASTAR軟件包中的SeqMan程序檢測(cè)并去除所有玫瑰EST序列中存在的載體序列，然后組裝拼接成Contigs。篩選EST-SNP位點(diǎn)原則：①候選SNP位點(diǎn)中的次要等位基因頻率至少為30%（李猛等，2012）；②候選SNP位點(diǎn)兩側(cè)至少有5 bp完全保守的序列。為篩選出可靠性更高的候選SNP位點(diǎn)，本研究對(duì)篩選方法進(jìn)行如下優(yōu)化：①?gòu)钠唇咏Y(jié)果中提取含有20條以上（包括20條）EST序列的Contigs篩選SNP位點(diǎn)；②候選位點(diǎn)人工篩選時(shí)，從步驟①中篩選出的候選SNP位點(diǎn)兩側(cè)至少有8個(gè)堿基（bp）完全保守且次要等位基因所占比例不低于40%。

1. 3 候選SNP所在核苷酸序列同源性比對(duì)

提取候選SNP位點(diǎn)兩端各約50 bp的EST序列，用NCBI上的BLASTn（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&L-

INK_LOC=blasthome）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，提取與比對(duì)序列相似性最高的序列注釋信息，對(duì)SNP靶向基因產(chǎn)物及物種來源進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 玫瑰EST序列聚類及EST-SNP位點(diǎn)分析結(jié)果

利用DNASTAR 7.1.0（44.1）軟件包中的SeqMan程序去除載體序列后，對(duì)27125條EST進(jìn)行拼接，共得到3544條Contigs。

2. 2 SNP位點(diǎn)人工篩選及分析結(jié)果

2. 2. 1 SNP位點(diǎn)人工篩選方法 對(duì)軟件篩選出的候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行人工篩選，進(jìn)一步提高候選SNP位點(diǎn)的可靠度。本研究在篩選候選SNP位點(diǎn)時(shí)，把包含4條EST序列的Contigs提高到至少包含20條EST序列的Contigs，同時(shí)在1個(gè)候選SNP位點(diǎn)兩側(cè)經(jīng)常出現(xiàn)間斷或連續(xù)的非SNP位點(diǎn)不保守區(qū)域。這些區(qū)域可能是在比對(duì)分析時(shí)序列錯(cuò)誤所引起，從而降低候選SNP位點(diǎn)的可靠度，為此本研究對(duì)人工篩選原則進(jìn)行以下改良：①候選SNP位點(diǎn)次要等位基因頻率不低于40%；②候選SNP位點(diǎn)兩側(cè)至少有8個(gè)核苷酸序列完全保守（圖1為合格SNP，圖2和圖3均為不合格SNP）。經(jīng)過篩選，發(fā)現(xiàn)含候選SNP位點(diǎn)的Contigs有243個(gè)，243個(gè)Contigs的堿基總數(shù)為262785 bp；經(jīng)過人工篩選，發(fā)現(xiàn)有224個(gè)SNP位點(diǎn)，SNP出現(xiàn)頻率為0.085%，即平均1173 bp就含有1個(gè)SNP位點(diǎn)（表1）。對(duì)Contigs中含有SNP位點(diǎn)的Contig進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（圖4）顯示構(gòu)成Contigs的EST序列數(shù)量與其包含的SNP位點(diǎn)數(shù)量并無明顯規(guī)律。

2. 2. 2 SNP堿基變化及插入缺失分析結(jié)果 對(duì)包含EST數(shù)量大于20條的Contigs產(chǎn)生的224個(gè)堿基突變類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有134個(gè)轉(zhuǎn)換類型和61個(gè)顛換類型（圖5），分別占候選SNP位點(diǎn)總數(shù)的59.8%和27.2%，轉(zhuǎn)換與顛換比為2.2∶1.0。除轉(zhuǎn)換和顛換類型之外，還有29個(gè)堿基發(fā)生插入和缺失類型，約10個(gè)堿基突變中就有1.29個(gè)堿基發(fā)生插入或缺失突變。

2. 3 候選SNP位點(diǎn)所在核苷酸序列同源性比對(duì)結(jié)果

提取195個(gè)轉(zhuǎn)換和顛換SNP位點(diǎn)位置兩側(cè)約100 bp的核苷酸序列在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有41個(gè)SNP位點(diǎn)無比對(duì)結(jié)果，可能是玫瑰特有且尚未被發(fā)現(xiàn)的基因，但需進(jìn)一步驗(yàn)證；其他SNP位點(diǎn)的比對(duì)結(jié)果見表2。由表2可知，含SNP位點(diǎn)的基因分屬于22類，分別為：1個(gè)3，5-二甲氧基基因（AB972813.1），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；1個(gè)5羥基甲苯3，5-二甲氧基基因（AF502434.1），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；1個(gè)60S酸性核糖體蛋白P2（EU244401.1），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；3個(gè)KRMP基因家族成員（KC494061.1、EF183518.1和EF183519.1），含有3個(gè)SNP位點(diǎn)；1個(gè)捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白（XM_004303830.2），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；2個(gè)ribosomal基因（KT179782.1），含有2個(gè)SNP位點(diǎn)；2個(gè)shematrin基因家族基因（KC505165.1和KC505166.1），含有2個(gè)SNP位點(diǎn)；1個(gè)二磷酸羧化酶基因（M25613.1），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；1個(gè)翻譯延伸因子1A基因（AY171463.1），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；2個(gè)泛素蛋白基因（XM_010086632.1和XM_013082359.1），含有2個(gè)SNP位點(diǎn)；1個(gè)非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白基因（XM_011468119.1），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；1個(gè)富含甘氨酸蛋白基因（XM_011468831.1），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；1個(gè)甲氧基5羥基甲苯基因（AF502433.1），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；2個(gè)金屬硫蛋白基因（AJ001444.1和KC222014.1），包含1個(gè)SNP位點(diǎn)；2個(gè)殼基蛋白基因（HE610403.1和HE610383.1），含有2個(gè)SNP位點(diǎn)；1個(gè)衰老相關(guān)蛋白基因（XM_013587541.1），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；5個(gè)苔黑酚轉(zhuǎn)甲基酶蛋白基因（AJ439741.1、HQ423170.1、AM182831.1、AM182833.1和AB972813.1），含有5個(gè)SNP位點(diǎn)；2個(gè)鐵結(jié)合蛋白基因（KM369969.1和XM_004302530.2），含有2個(gè)SNP位點(diǎn)；3個(gè)細(xì)胞色素氧化酶亞基基因（DQ337258.1、KF284069.1和GQ452847.1），含有3個(gè)SNP位點(diǎn)；1個(gè)淀粉酶基因（XM_004296501.2），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；1個(gè)珍珠層蛋白基因（HQ259055.1），含有1個(gè)SNP位點(diǎn)；另外，還有6個(gè)未知功能的基因（FN566841.1、XM_004291435.2、EU244360.1、HG670306.1、EF119787.1和GU263799.1）。

從含有SNP位點(diǎn)相關(guān)同源基因的物種分布來看，有22個(gè)SNP位點(diǎn)來源于薔薇科植物（與玫瑰同科），其中來源于野草莓的基因最多（8個(gè)），說明同科植物基因間存在較高同源性。本研究還發(fā)現(xiàn)有15個(gè)SNP位點(diǎn)所在的基因與軟體動(dòng)物門物種的基因具有較高同源性，其中大珠母貝和黑蝶真珠蛤所占比重最高，各有5個(gè)，說明玫瑰基因與某些水生軟體動(dòng)物的基因也具有較高同源性。

3 討論

目前，SNP已在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建（Hyte et al.，2010）、重要性狀相關(guān)基因定位（Singh et al.，2010）、遺傳多樣性分析（Van Inghelandt et al.，2010；吳永升等，2014）及動(dòng)植物品種鑒定（Jiang et al.，2010）等相關(guān)領(lǐng)域的研究中得到廣泛應(yīng)用，基于EST序列的SNP標(biāo)記也被應(yīng)用到牛、豬、玉米、小麥、松樹、枇杷等多種動(dòng)植物中，但SNP標(biāo)記也存在缺陷，如測(cè)序階段成本較高而限制其在相關(guān)領(lǐng)域的大規(guī)模開發(fā)。利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)，并結(jié)合生物信息學(xué)知識(shí)及相關(guān)分析軟件進(jìn)行SNP標(biāo)記開發(fā)，再制定針對(duì)候選SNP位點(diǎn)的驗(yàn)證方法，因其具有開發(fā)成本低、快捷高效等優(yōu)點(diǎn)，已成為廣大科研工作者普遍青睞的SNP標(biāo)記開發(fā)方法（Kim and Misra，2007）。EST來源于功能基因表達(dá)的cDNA片段，是在轉(zhuǎn)錄區(qū)域進(jìn)行多態(tài)性辨別的重要數(shù)據(jù)源，且因相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中增速最快的核苷酸序列是EST序列，使得以EST序列為基礎(chǔ)進(jìn)行相關(guān)分子標(biāo)記開發(fā)變得越來越方便。

本研究中從NCBI中dbEST公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載27125條EST序列，共有17372條EST序列參與拼接，拼接成3544個(gè)Contigs，所含EST序列≥20條的Contigs數(shù)共265個(gè)，從中篩選出224個(gè)候選SNP位點(diǎn)，SNP頻率為 1/1173 bp，較其他物種的SNP頻率低（Lijavetzky et al.，2007），主要與研究材料間的遺傳背景差異有關(guān)，即SNP頻率越高表明其遺傳背景差異越大（Van Tassell et al.，2008）。本研究還發(fā)現(xiàn)，SNP位點(diǎn)堿基變異類型以G/A最高占59.8%，與人類、大豆、玉米、大麥、小麥、辣椒等物種的SNP堿基變異類型（Huang and Madan，1999；Chao et al.，2008；Sato et al.，2011；劉峰等，2014）不符。其中，轉(zhuǎn)換類型和顛換類型的數(shù)量分別占候選SNP位點(diǎn)總數(shù)的59.8%和27.2%，轉(zhuǎn)換與顛換比為2.2∶1.0，即轉(zhuǎn)換類型的數(shù)量明顯高于顛換類型數(shù)量，與Garg等（1999）、Deutsch等（2001）的研究結(jié)果一致。此外，構(gòu)成Contigs的EST序列數(shù)量與其包含的SNP位點(diǎn)數(shù)量并無明顯規(guī)律，與Duran等（2009）、周錦等（2011）的研究結(jié)果存在差異，可能與不同物種間SNP位點(diǎn)的分布差異有關(guān)系。本研究篩選獲得的SNP位點(diǎn)中有42個(gè)位點(diǎn)被注釋到22個(gè)基因上，未被注釋的序列多為未知功能基因，尚需進(jìn)一步探究。除有22個(gè)SNP位點(diǎn)來源于薔薇科植物外，還有15個(gè)SNP位點(diǎn)來源于軟體動(dòng)物門物種，是前人研究中未發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象，值得深入研究。

隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，測(cè)序的準(zhǔn)確率及效率也將不斷得到改進(jìn)，通過生物信息學(xué)知識(shí)及相關(guān)分析軟件發(fā)掘候選SNP位點(diǎn)，然后針對(duì)性地進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證將成為一種高效的SNP標(biāo)記開發(fā)方式。尤其是EST-SNP的高效開發(fā)，將進(jìn)一步推動(dòng)植物遺傳背景、遺傳圖譜構(gòu)建、相關(guān)性狀分子標(biāo)記等相關(guān)研究領(lǐng)域的發(fā)展。

4 結(jié)論

NCBI中的玫瑰EST數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)龐大，足夠發(fā)掘出大量的SNP標(biāo)記，使得以EST-SNP對(duì)薔薇科玫瑰等植物進(jìn)行品種鑒定、分類、遺傳多樣性分析具有可行性。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）