閆艷華 王鵬 楊衛(wèi)民

關(guān)鍵字：核桃分心木；分心木提取液；抑菌效果；最低抑菌濃度

文章編號(hào)：1005345X（2016）03000104中圖分類號(hào)：S664.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A核桃（Juglans regia L.）是殼斗目，核桃科，核桃屬的一種落葉喬木[1]。呂梁地區(qū)栽種核桃歷史悠久，目前結(jié)果的核桃樹面積達(dá)5萬(wàn)hm2，全年總產(chǎn)量為1 740萬(wàn)kg，分心木的量為2 000 t。根據(jù)呂梁市十二五的規(guī)劃要求，該市在十二五末要實(shí)現(xiàn)種植總量33萬(wàn)hm2，年總產(chǎn)7 874萬(wàn)kg，屆時(shí)分心木的量也會(huì)達(dá)到10 000 t左右。實(shí)際生活中，核桃分心木大多被丟棄[2]，沒(méi)有得到充分的利用，如果能夠充分開發(fā)利用核桃分心木，將會(huì)使核桃的價(jià)值進(jìn)一步提升[3-4]。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

材料：核桃分心木取自呂梁本地；大腸桿菌E.coli，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus，均為呂梁學(xué)院實(shí)驗(yàn)室貯藏菌種；甲醇、乙醇、石油醚均采購(gòu)于上海。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1提取液的制備甲醇提取核桃分心木中的抑菌物質(zhì)：把經(jīng)過(guò)風(fēng)干后的核桃分心木搗碎。電子天平稱取50 g樣品倒進(jìn)試劑瓶里，再向瓶中加450 mL甲醇（邊加邊攪拌），薄膜封口， 25 ℃下放置3 d，注意每天隔一段時(shí)間攪拌1次。3 d后把試劑瓶置于恒溫水浴鍋中回流提取60 min，將所得液體用抽濾泵濾過(guò)一次后放到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮。將最后的濃縮液放到60 ℃干燥箱中干燥直至有固體顆粒出現(xiàn)，取出并加入甲醇配置成10 mL溶液，貼上標(biāo)簽，置于0～3 ℃冰箱中，貯藏備用[5-6]。乙醇、石油醚提取核桃分心木中的抑菌物質(zhì)：分別稱取50 g樣品倒進(jìn)試劑瓶里，之后向試劑瓶里加450 mL乙醇和石油醚，方法同上。

1.2.2供試菌種活化從冰箱中取出保存的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌種， 25 ℃下放置24 h后將這兩種供試菌在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接種到試管培養(yǎng)基里面，每種細(xì)菌重復(fù)接5支；放到37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，選擇一支長(zhǎng)勢(shì)比較好的菌株作為試驗(yàn)菌種，其余的置0～4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.3菌懸液的制備用接種環(huán)挑少許活化菌種放到經(jīng)過(guò)滅菌后的9 mL的0.9%的生理鹽水中，搖勻，10倍稀釋法稀釋，然后將稀釋后的每個(gè)菌懸液用移液槍吸取1μL至血球計(jì)數(shù)板上再拿到顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，估算出1 mL的含菌量，反復(fù)操作直至得到含菌量為（6～7）×104個(gè)/mL的菌懸液。

1.2.4固體平板的制備牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g，將上述試劑混合倒入蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH到7.3；加熱煮 山西果樹SHANXIFRUITS 2016（3）1沸使藥品完全溶解， 121 ℃滅菌30 min。待培養(yǎng)基溫度降到55 ℃左右，在無(wú)菌條件下倒入經(jīng)過(guò)滅菌且干燥后的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約175～180 mL，最后得到相同規(guī)格的12個(gè)盛有等量培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿。

1.2.5不同濃度各提取液的制備把上面制成的10 mL各提取液的濃度定為1，然后將其分別連續(xù)稀釋成6種不同濃度；分別是100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%的核桃分心木甲醇提取液、乙醇提取液和石油醚提取液[7]。

1.2.6含抑菌成分濾紙片的制備將濾紙制成半徑為3 mm的小圓片數(shù)個(gè)，置于玻璃容器內(nèi)，滅菌，風(fēng)干。之后將其分別放到盛有7種濃度（包括對(duì)照）的3種不同提取液中浸泡 3 h后貼在燒杯壁上晾干。

1.2.7抑菌效果的檢測(cè)按無(wú)菌操作向各培養(yǎng)皿中等量加入0.6 mL兩種供試菌的菌懸液，用三角涂布器涂布均勻。濾紙片按規(guī)范操作放在不同含菌培養(yǎng)皿中，另取浸泡在甲醇、乙醇及石油醚中的濾紙片做空白對(duì)照，分別記作 ck1、ck2、ck3，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放7張濾紙片。置于37 ℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h，檢測(cè)是否有抑菌圈出現(xiàn)，如果有抑菌圈就分別量出各抑菌圈的直徑[8]。

1.2.8最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定MIC值即提取液的最低抑菌濃度，是指在培養(yǎng)基中完全沒(méi)有菌能夠存在的各提取液的最低濃度。在該試驗(yàn)中測(cè)定各提取液不同濃度的抗菌能力時(shí)采取固體平板，用MIC值來(lái)表示各提取液不同濃度的抑菌效果。

2結(jié)果與分析

2.1抑菌圈法測(cè)定抑菌效果

2.1.1核桃分心木甲醇提取液的抑菌效果由圖1可知，核桃分心木甲醇提取液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌這2種供試菌都有抑制作用。較高濃度的提取液表現(xiàn)出較為明顯的抑菌圈，表明抑菌能力較好，低濃度的提取液抑制效果較差，高濃度與低濃度之間的抑菌能力差別不是很明顯，隨著濃度的升高抑制作用差異逐漸增大但變化不太大。對(duì)照甲醇的抑菌圈直徑為6 mm，為抑菌濾紙片的直徑，無(wú)抑制作用，說(shuō)明抑菌效果是分心木的作用，而非甲醇的作用。

2.1.2核桃分心木乙醇提取液的抑菌效果由圖2可知，不同濃度乙醇提取液對(duì)各種供試菌都有較好的抑制能力，其中對(duì)大腸桿菌的抑制能力比對(duì)金黃色葡萄球菌強(qiáng)，并且隨著提取液濃度的降低，提取液對(duì)這兩種菌的抑制效果差異逐漸減小。高濃度的提取液能形成明顯的抑菌圈，說(shuō)明抑菌作用顯著，而低濃度的提取液未發(fā)現(xiàn)清晰的抑菌圈，抑菌作用較差，且高濃度與低濃度的抑菌作用差異顯著。對(duì)照乙醇的抑菌圈不明顯，基本沒(méi)有抑菌能力，說(shuō)明抗菌效果來(lái)源于分心木。與甲醇提取物相比，此提取物較甲醇提取物抑菌效果要好。

2.1.3核桃分心木石油醚提取液的抑菌效果石油醚提取液未形成明顯抑菌圈，表明該提取液對(duì)這兩供試細(xì)菌都沒(méi)有表現(xiàn)出比較好的抑制效果，浸泡在石油醚中的濾紙片在含有供試菌的各培養(yǎng)基上都沒(méi)有呈現(xiàn)抑菌圈，該試劑無(wú)抑菌作用；和上面兩種提取液相比，此提取液的抗菌效能最差。

2.2各提取液的最低抑菌濃度（MIC）

由圖3可知，甲醇和乙醇提取液對(duì)這兩種 閆艷華等：核桃分心木提取液抑菌效果初探 1菌的最低抑菌濃度不同，而石油醚提取液無(wú)抑菌作用。甲醇提取液對(duì)大腸桿菌MIC值是3.125%，而對(duì)金黃色葡萄球菌MIC值是6.25%；乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值是12.5%，對(duì)大腸桿菌的為6.25%，所以此試驗(yàn)中兩種提取液濃度對(duì)大腸桿菌的MIC值最低。兩種提取液無(wú)論是在同濃度下還是不同濃度下對(duì)大腸桿菌的抑制作用總是比金黃色葡萄球菌顯著。由圖3可知，各提取物中兩種甲醇提取物的抑菌效果最佳，說(shuō)明甲醇提取抑菌物的效果最好，乙醇次之，石油醚最差。

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)對(duì)核桃分心木3種提取液的抑菌作用進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)核桃分心木的甲醇提取液和乙醇提取液有明顯的抑菌效果，但石油醚提取液未檢測(cè)出抑菌能力，另外核桃分心木甲醇提取液的抑菌能力比乙醇提取液有更為顯著的抗菌活性，并且抗菌效能隨著提取液濃度的縮小而逐漸衰減；甲醇提取液濃度在6.25%時(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種細(xì)菌都有抑制能力；而乙醇提取液在12.5%才對(duì)兩種細(xì)菌有抑制能力。甲醇提取液對(duì)大腸桿菌的MIC值是3.125%，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值是6.25%，乙醇提取液對(duì)大腸桿菌的MIC值是6.25%，而對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值是12.5%。

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)記載核桃分心木中存在大量的化學(xué)物質(zhì)，其中包括黃酮、生物堿、有機(jī)酸或酚性成分等，比較甲醇提取液、乙醇提取液與石油醚提取液這3種試劑檢測(cè)出的成分，黃酮類物質(zhì)和酚性成分能被甲醇、乙醇和石油醚試劑所提取[7，9]，但石油醚卻未能檢測(cè)出抑菌效果，這說(shuō)明石油醚提取出分心木中的抑菌成分的量很少或提取方法不當(dāng)，所以沒(méi)有表現(xiàn)出抑制細(xì)菌的作用；而同時(shí)黃酮類等酚性物質(zhì)都能夠抑制細(xì)菌，所以此次試驗(yàn)檢測(cè)出的抑菌成分可能是黃酮或酚性物質(zhì)，這有待今后進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。到目前為止，由于缺乏對(duì)分心木系統(tǒng)性和綜合性的研究，人們對(duì)于核桃分心木的抑菌功效還掌握的比較少，所以我們要提取分心木中的化學(xué)成分做有關(guān)抑菌作用的研究，此次試驗(yàn)是對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）的抑制作用的研究，期望將來(lái)有關(guān)于抑制常見(jiàn)真菌的研究，以便準(zhǔn)確了解其抑菌效果，并進(jìn)行充分地利用；該試驗(yàn)對(duì)于核桃分心木的抗菌效能的研究希望能為核桃分心木的綜合利用及探明其藥用物質(zhì)基礎(chǔ)與食品天然防腐劑領(lǐng)域中的合理開發(fā)利用提供有力的依據(jù)，并能夠開辟出一條新的途徑，最終提高核酸化的綜合開發(fā)利用價(jià)值。

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