李馳榮 黃惠 龔盛昭 陳慶生 李麗 董銀卯

機(jī)體在代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生活性氧自由基，也不斷地被消除，使機(jī)體維持有利無(wú)害、低水平、穩(wěn)定平衡的生理性自由基含量。但過(guò)量自由基可造成機(jī)體細(xì)胞非特異性氧化損傷，而引發(fā)各種疾病。如心腦血管疾病、癌癥、艾滋病、糖尿病、早老性癡呆、震顫麻痹癥等幾乎都與氧自由基代謝有關(guān)。二苯代苦味酰自由基（1，1-diphenyl-2-piciylhydrazyl freeradical，DPPH）分光光度法是近些年發(fā)展起來(lái)的一種篩選抗氧化劑的簡(jiǎn)便方法，其原理是利用DPPH溶液在517nm處的特征吸收峰，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，自由基清除劑與DPPH單電子配對(duì)而使其吸收逐漸減弱甚至消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，樣品的抗氧化活性可以通過(guò)清除DPPH的量來(lái)評(píng)價(jià)，因而可用分光光度法進(jìn)行定性定量分析。該方法有簡(jiǎn)便、靈敏、直接等特點(diǎn)。本文采用DPPH法測(cè)定18種中藥提取物不同濃度下的抗氧化活性，利用Folin-Ciocalteu法測(cè)定這些中藥提取物中的總多酚含量，及采用硝酸鋁亞硝酸鈉比色法測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果表明：各中藥的抗氧化活性不同，其中不同濃度的地榆、地榆炭、虎杖的抗氧化活性最好，總酚酸及總黃酮含量相對(duì)較高。本文篩選結(jié)果對(duì)中藥提取物在美白化妝品配方中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1.材料與試劑

藥材：牡丹皮、玉竹、炒白術(shù)、地榆炭、生白術(shù)、烏梅、地榆、甘草、川芎、金櫻子、蒼術(shù)、當(dāng)歸、葛根、桑葚、白蘞、紅花、桑葉、虎杖中藥均購(gòu)自于京同仁堂藥店。

2.主要試劑與儀器

沒(méi)食子酸，AI（NO3）3，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁，百靈威科技；鹽酸，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司：甲醇、NANO2、NaOH、碳酸鈉，西隴化工股份有限公司；Folin-Ciocalteu試劑，北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯-2-三硝基苯肼（DPPH）試劑、維生素C（VC）、乙醇，北京化工廠。上述試劑均為分析純。

CQ-250超聲波清洗器，上海超聲波儀器廠：酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，DZKW-S-4）；TB-2002電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ-400KDB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司：SIGMA 4K15離心機(jī)，北京博勱行儀器有限公司；GX-04粉碎機(jī)，上海高翔食品機(jī)械廠，移液槍（1mL/5mL，Eppendorf，20055793/R34489B）；旋渦混合器（MX-F，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司）

實(shí)驗(yàn)方法

1.提取物制備方法

把18種植物粉碎后，各取4g，然后用95%乙醇80mL，室溫浸泡1h，超聲提取20min，用濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得各植物的提取液。

2.DPPH清除率實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)參考s nchez-Vioque等的方法并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行修改。通過(guò)測(cè)定不同樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力以考查其抗氧化活性。

DPPH乙醇溶液的配制：準(zhǔn)確稱取20mg DPPH，加入無(wú)水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.08g/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液，0～4℃下避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

VC水溶液的配制：準(zhǔn)確稱取25mgVC，加入去離子水溶解并定容于250mL容量瓶中，配制為質(zhì)量濃度為100μg/mL的VC水溶液。

1.0mL樣品溶液（或VC水溶液）與1..mL40μg/mL的DPPH·溶液混合，室溫下黑暗中放置10min后，于517nm處測(cè)吸光度。DPPH·清除率的計(jì)算公式如下：

DPPH·清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]*100%

式中，A0為未加提取物溶液的DPPH·吸光度值；A1為加提取物溶液的DPPH·吸光度值；A2為提取物溶液吸光度值。

3.18種樣品提取液總酚酸、總黃酮含量的測(cè)定

總酚酸含量的測(cè)定采用FolinCiocalteu法。對(duì)照品溶液：稱取0.1g沒(méi)食子酸，用蒸餾水溶解、定容至100mL，此溶液質(zhì)量濃度為1.0g/L。分別吸取上述溶液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10mL至10mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，所得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g/L。將甲醇與體積分?jǐn)?shù)為0.3%的鹽酸按體積之比6：4混勻，分別取不同濃度的沒(méi)食子酸對(duì)照品100μL于試管中，依次加入100μL甲醇鹽酸混合液，2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的碳酸鈉水溶液，混勻。靜止2min后加入體積分?jǐn)?shù)為50%的Folin-Ciocalteu試劑100μL，暗處理30min，分別測(cè)定在750nm下的吸光度。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.6203x+0.1241，r=0.9994（y值為吸光度，x值為加樣質(zhì)量濃度）。

供試品溶液：取上述不同樣品提取液，按照上述步驟操作，在750nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

總黃酮含量的測(cè)定采用硝酸鋁亞硝酸鈉比色法。精密稱取蘆丁對(duì)照品0.1 g，用體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇溶解、定容至100mL容量瓶，此溶液質(zhì)量濃度為1.0g/L。精密吸取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL于10mL容量瓶，用體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL的對(duì)照品溶液。分別取1mL不同濃度的蘆丁樣品于10mL容量瓶中，依次加入4mL去離子水、0.3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaN02水溶液，5min后加入0.3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的AI（N03）3水溶液，反應(yīng)1min后依次加入2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaOH水溶液，2.4mL去離子水，510nm下測(cè)定吸光度。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.3908x-0.026，r=0.9941（y值為吸光度，x值為加樣質(zhì)量濃度）。

供試品溶液：取上述不同樣品提取液，按照上述步驟操作，在510nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

結(jié)果與討論：

各種天然提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力如表1所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，18種中藥的95%乙醇提取物中，不同濃度的地榆、地榆炭、虎杖的抗氧化活性最好，牡丹皮、甘草、川芎、金櫻子、白蘞具有較好的抗氧化活性，其他中藥的乙醇提取物，在測(cè)定濃度下（0.5%，1.0%，2.0%），沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性。

總酚酸及總黃酮含量如表2所示，從測(cè)定結(jié)果中可以看出其總酚酸總黃酮含量：地榆>虎杖>地榆炭，抗氧化活性測(cè)定結(jié)果與總酚酸及總黃酮含量有一定相關(guān)性。

結(jié)論：

人體中的自由基與許多疾病的生成與發(fā)展有密切聯(lián)系，受控的自由基對(duì)人體是有益的，但當(dāng)人體中的自由基超過(guò)定的量，便會(huì)失去控制，給我們的生命帶來(lái)傷害，因此不斷去發(fā)現(xiàn)具有抗氧化活性的天然植物是非常必要而有意義的。自由基還是引起皮膚衰老的重要原因，自由基在黑色素的形成、結(jié)構(gòu)和反應(yīng)中起著重要作用，所以具有抗氧化活性的植物中藥可以在美白與抗衰老化妝品中有廣泛應(yīng)用。通過(guò)對(duì)18種植物抗氧化活性與成分的分析可以看出：地榆、地榆炭、虎杖具有很強(qiáng)的自由基清除能力，牡丹皮、甘草、川芎、金櫻子、白蘞也具比較強(qiáng)的自由基清除能力。同時(shí)，地榆、地榆炭、虎杖的總酚酸與總黃酮的含量也較高。