胡立華　陳鵬　常英娟

[摘要] 目的 探討微小RNA-22（miRNA-22）在食管癌組織中的表達(dá)及與食管癌臨床病理特征間的關(guān)系。 方法 采用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）法檢測(cè)48例食管癌及癌旁組織中miRNA-22的表達(dá)水平，分析miRNA-22表達(dá)水平與食管癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。 結(jié)果 食管癌組織中miRNA-22相對(duì)表達(dá)量明顯低于相應(yīng)正常癌旁組織（3.51±1.05 vs 11.23±2.95），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。miRNA-22低表達(dá)與腫瘤TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而與性別、年齡、分化程度無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。 結(jié)論 miRNA-22在食管癌組織中的表達(dá)下調(diào)與食管癌的臨床病理特征密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 微小核糖核酸；食管癌；微小核糖核酸-22；實(shí)時(shí)定量PCR

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）16-0021-03

[Abstract] Objective To investigate the expression of miRNA-22 in esophageal cancer tissues and the relationship with the clinical pathologic features. Methods Real-time PCR was used to detect the miRNA-22 expressions among 48 cases of esophageal cancer tissues and matched adjacent tissues.The expression of miRNA-22 and clinic pathological features were analyzed. Results The esophageal cancer tissues showed aberrant down regulation of miRNA-22 compared with the adjacent non-tumor tissues（3.51±1.05 vs 11.23±2.95， P<0.05）.Lower miRNA-22 level was strongly associated with TNM stage and lymph node metastasis（P<0.05）. The correlation statistical analysis result indicated that there was no significant difference in sex， age and differentiation grade（P>0.05）. Conclusion The lower expression of miRNA-22 in esophageal cancer tissues is associated with clinic pathological features.

[Key words] MicroRNA； Esophageal cancer； MicroRNA-22； Real-time PCR

食管癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。由于早期缺乏特異性癥狀，臨床確診的食管癌病例多為中、晚期患者，其5年生存率僅為10%左右。因而探索敏感、特異的腫瘤標(biāo)記物，早期診斷，對(duì)降低食管癌的死亡率尤為重要。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）表達(dá)失調(diào)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為腫瘤標(biāo)記物用以腫瘤的診斷及治療。本研究通過(guò)檢測(cè)miRNA-22在食管癌及癌旁組織中的表達(dá)，旨在探討其與食管癌臨床病理特征之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年1～12月黑龍江省醫(yī)院及黑龍江省腫瘤醫(yī)院外科手術(shù)切除的食管癌及癌旁正常組織標(biāo)本48例，液氮凍存30 min，-80℃保存，所有樣品均經(jīng)病理診斷證實(shí)，術(shù)前均未接受放、化療。其中男34例，女14例，年齡41～88歲。癌癥分期按國(guó)家癌癥聯(lián)盟（UICC）第7版指南標(biāo)準(zhǔn)劃分，其中Ⅱ期15例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例，分化程度：中分化33例，低分化15例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例。

1.2 總RNA提取

將食管癌及癌旁正常組織研碎，利用Trizol法提取組織總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，紫外分光光度儀檢測(cè)RNA溶液的D260/D280比值，取比值在1.8～2.1者行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)miRNA-22

采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：16℃ 30 min，42℃ 45 min，85℃ 5 min。miRNA-22 PCR擴(kuò)增的上游引物序列為5-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTA-3，下游引物序列為5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 sec，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。同時(shí)選取U6 snRNA 為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)反復(fù)3次。U6內(nèi)參的上游引物5GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3，下游引物R：5CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3。RT-PCR結(jié)果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt比較各樣品間miRNA-22的表達(dá)差異[2]，ΔCt=待檢樣品的miRNA-22 Ct值-該樣品的U6 Ct值，ΔΔCt值=食管癌組織的 ΔCt 值-癌旁組織的ΔCt值。

1.4 觀察指標(biāo)

以食管癌組織中miRNA-22表達(dá)量的中位數(shù)為分界點(diǎn)將其分為低表達(dá)組和高表達(dá)組[3]，分析兩組與食管癌患者性別、年齡、腫瘤分化程度、TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-22在食管癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

經(jīng)qPCR技術(shù)檢測(cè)，食管癌組織中miRNA-22相對(duì)表達(dá)量為（3.51±1.05），明顯低于相應(yīng)正常癌旁組織的（11.23±2.95），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.831，P<0.05）。

2.2 miRNA-22的表達(dá)與食管癌臨床病理特征之間的關(guān)系

食管癌組織中miRNA-22表達(dá)水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期（Ⅲ+Ⅳ）密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miRNA-22的低表達(dá)率為94.4%（34/36），顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的41.7%（5/12），Ⅳ期患者miRNA-22的低表達(dá)率為90.9%（10/11），明顯高于Ⅲ期患者的81.8%（18/22）和Ⅱ期患者的73.3%（11/15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而與患者性別、年齡及腫瘤分化程度無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

MicroRNA是一類(lèi)長(zhǎng)約20～22個(gè)核苷酸的小分子RNA，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)約70 nt的miRNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成[4]，其通過(guò)與靶mRNA分子的3端非編碼區(qū)（3UTR）互補(bǔ)結(jié)合使目標(biāo)mRNA分子受到翻譯水平調(diào)控或?qū)е缕浣到?，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分化、能量代謝、凋亡等生理過(guò)程[5]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的miRNA表達(dá)譜有明顯差異，約50%已知miRNA基因組定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)，通?？梢种颇[瘤細(xì)胞的表達(dá)[6]。

分子靶向治療是目前腫瘤治療的熱點(diǎn)，大多數(shù)靶向治療藥物主要針對(duì)與腫瘤相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中的某個(gè)重要分子，但由于細(xì)胞中存在著多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，阻斷其中一個(gè)分子并不能完全起到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。一個(gè)miRNA可以同時(shí)作用于多個(gè)靶基因，通過(guò)調(diào)控miRNAs的表達(dá)水平或可更廣泛地調(diào)控細(xì)胞中相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，取得更好的抗腫瘤效果。有些miRNA在腫瘤中低表達(dá)或不表達(dá)，可采用外源miRNA基因?qū)氙煼?。有些miRNA在腫瘤中高表達(dá)，可采用相應(yīng)的方法下調(diào)miRNA的表達(dá)。由此可見(jiàn)，尋找與腫瘤相關(guān)的miRNAs并明確其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用對(duì)腫瘤的治療具有重大意義。

2002年首次在慢性粒細(xì)胞白血病人群中發(fā)現(xiàn)，超過(guò)50%患者miRNA-15a和miRNA-16-l低表達(dá)或缺失[7]，此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種腫瘤中miRNA表達(dá)失調(diào)[8-14]。Feber等[15]比較了食管癌組織與正常上皮組織中miRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-203和miRNA-205在食管癌組織中的表達(dá)下調(diào)，而miRNA-21的表達(dá)上調(diào)。Tian等[16]研究指出miRNA-10b在食管癌細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)，并通過(guò)調(diào)控KLF4 基因，參與食管癌的發(fā)生。Hiyoshi等[17]檢測(cè)20例食管癌及癌旁正常組織和7種食管癌細(xì)胞系中miRNA-21的表達(dá)，結(jié)果顯示：90%的癌組織miRNA-21表達(dá)上調(diào)，且與程序性細(xì)胞死亡基因4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Zhou等[18]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-214在食管鱗癌中表達(dá)下調(diào)并與食管鱗癌的病理分級(jí)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，選擇miRNA-22作為研究對(duì)象，分析48例食管癌手術(shù)患者標(biāo)本中癌組織與癌旁正常組織中miRNA-22的表達(dá)情況，并對(duì)臨床病理參數(shù)進(jìn)行縱向比較，結(jié)果表明：食管癌組織中miRNA-22的相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織（P<0.05）；食管癌組織中miRNA-22低表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期（Ⅲ+Ⅳ）間具有顯著相關(guān)性（P<0.05），提示miRNA-22在食管癌發(fā)生、發(fā)展中很可能具有抑癌基因的作用。因此，采用外源miRNA-22 基因?qū)牖蛑匦录せ羁赡艹蔀榭拱┲委熜碌难芯糠较颉?/p>

綜上所述，miRNA-22在食管癌組織中的表達(dá)下調(diào)與食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，miRNA-22可能成為食管癌診斷及治療的新的分子標(biāo)志。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Siegel R，Naishadham D，Jemal A. Cancer statistics，2013[J].CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

[2] Livak KJ，Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[3] Bloomston M，F(xiàn)rankel WL，Petrocca F，et al. MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis[J].JAMA，2007，297（17）：1901-1908.

[4] Kaufman EJ，Miska EA. The microRNAs of caenorhabditis elegans[J]. Semin Cell Dev Biol，2010，21（7）：728-737.

[5] Chen CZ，Li L，Lodish HF，et al. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation[J]. Science，2004，303（5654）：83-86.

[6] Calin GA，Sevgnani C，Dumitu CD，et al. Human microRNA genes are fequently located at fragile sites and genomic regions involved in caccers[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（9）：2999-3004.

[7] Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad SCi USA，2002，99（24）：15524-15529.

[8] Corcoran C，Rani S，Breslin S，et al. miR-630 targets IGF1R to regulate response to HER-targeting drugs and overall cancer cell progression in HER2 over-expressing breast cancer[J]. Molecular Cancer，2014，13（1）：71-81.

[9] Jung HS，Seo YR，Yang YM，et al. Galphagep oncogene inhibits FOXO1 in hepatocellular carcinoma as a consequence of miR-135b and miR-194 dysregulation[J]. Cell Signalling，2014，26（7）：1456-1465.

[10] Yang TS，Yang XH，Wang XD，et al. MiR-214 regulate gastric cancer cell proliferation， migration and invasion by targeting PTEN[J]. Cancer Cell Inter，2013，13（1）：68-78.

[11] Wang P，Chen L，Zhang J，et al. Methylation-mediated silencing of the miR-124 genes facilitates pancreatic cancer progression and metastasis by targeting Rac1[J].Oncogene，2014，33（4）：514-524.

[12] Shang J，Yang F，Wang Y，et al. MicroRNA-23a antisense enhances 5-fluorouracil chemosensitivity through APAF-1/caspase-9 apoptotic pathway in colorectal cancer cells[J]. J Cell Biochem，2014，115（4）：772-784.

[13] 付文博，魏育濤，羅波，等. MicroRNA：潛在的新型食管癌生物標(biāo)記[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，14（25）：4984-4986.

[14] 陳春曉，張宇忠. miRNA與消化系統(tǒng)腫瘤的關(guān)系[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（17）：2599-2601.

[15] Feber A，Xi L，Luketich JD，et al. MicroRNA expression profiles of esophageal cancer[J]. J Thorac Cardiovasc Surg，2008，135（2）：255-260.

[16] Tian Y，Luo A，Cai Y，et al. MicroRNA-10b promotes migration and invasion through KLF4 in human esophageal cancer cell lines[J]. J Biol Chem，2010，285（11）：7986-7994.

[17] Hiyoshi Y，Kamohara H，Karashima R，et al. MicroRNA-21 regulates the proliferation and invasion in esophageal squamous[J]. Clin Cancer Res，2009，15（6）：1915-1922.

[18] Zhou Y，Hong L. Prediction value of miR-483 and miR-214 in prognosis and multidrug resistance of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Genet Test Mol Biomarkers，2013，17（6）：470-474.

（收稿日期：2016-03-28）