桂明春 李玲 管艷 王亞 田海 梁國(guó)平

摘 要 為了探索基本培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)橡膠樹(shù)幼態(tài)微型芽條培育的影響情況，以橡膠樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系‘云研73-477花藥體胚植株為外植體，采用正交試驗(yàn)法研究了MS營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)橡膠樹(shù)幼態(tài)微型芽條培育的影響。結(jié)果表明：以莖段為外植體培育幼態(tài)微型芽條時(shí)，MS培養(yǎng)基中4種營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)誘導(dǎo)率的影響均不顯著；大量元素、有機(jī)成分及鐵鹽對(duì)繁殖系數(shù)的影響差異極顯著；微量元素、有機(jī)成分及鐵鹽對(duì)死亡率的影響差異極顯著，理論上最優(yōu)組合為全量大量元素+4/5微量元素+全量有機(jī)成分+全量鐵鹽；以莖尖為外植體培育幼態(tài)微型芽條時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中，外植體無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生，均有新芽產(chǎn)生；大量元素、微量元素及鐵鹽對(duì)繁殖系數(shù)的影響差異極顯著，而有機(jī)成分不顯著，理論上最優(yōu)組合為2/5大量元素+2/5微量元素+4/5有機(jī)成分+全量鐵鹽。

關(guān)鍵詞 橡膠樹(shù)；MS；幼態(tài)微型芽條；誘導(dǎo)率；繁殖系數(shù)

中圖分類(lèi)號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Apex and nodal cuttings of rubber variety Yunyan 73-477 were taken as the explants， and the effects of MS elements on in vitro culture of micro-shoots were studied by an orthogonal experiment. The results showed that the effects of 4 elements in MS on the inductive rate were not significantly different at 0.05 level when nodal cuttings were selected as in vitro micro-shoots， while macronutrients， organic nutrients and iron salt had significant effects on both multiplication rate and death rate at 0.01 level. The optimum combination was macronutirents+4/5 micronutrients + organic nutrients + iron salt. No explants death was observed during culture when apex was selected as in vitro micro-shoots and all explants sprouted. The effects of macronutrients， micronutrients and iron salt on the propagation coefficient were significantly different at 0.01 level， whereas it was not significant in organic nutrients. The optimum combination was 2/5 macronutrients + 2/5 micronutrients + 4/5 organic nutrients + iron salt.

Key works Hevea brasiliensis； MS elements； Micro-shoots； Inductive rate； Multiplication rate

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.001

目前，天然橡膠生產(chǎn)中，老態(tài)芽接無(wú)性系因其能保持母樹(shù)干膠產(chǎn)量相對(duì)較高的特性而被廣泛作為植膠材料[1]。但其生長(zhǎng)慢，經(jīng)濟(jì)壽命短，抗逆性差，適應(yīng)性小[2]，在一定程度上制約了天然橡膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。幼態(tài)芽接無(wú)性系較老態(tài)芽接無(wú)性系生長(zhǎng)速度快，干膠產(chǎn)量高，僅次于自根幼態(tài)無(wú)性系[1]，據(jù)此，在自根幼態(tài)無(wú)性系還不能滿(mǎn)足大面積推廣種植之前，推廣應(yīng)用幼態(tài)芽接無(wú)性系，無(wú)疑是一種提升天然橡膠產(chǎn)業(yè)的有效途徑[3]。目前，幼態(tài)芽接無(wú)性系的培育技術(shù)已趨成熟[1]，該技術(shù)將離體培養(yǎng)的橡膠樹(shù)幼態(tài)微型芽條和籽苗芽接技術(shù)結(jié)合起來(lái)，不僅解決了籽苗芽接操作過(guò)程中由接穗與砧木大小不匹配所造成的困難，提高芽接成活率，且在芽接操作時(shí)，不必剖離芽片的木質(zhì)部，使芽接速度顯著提高。但目前適合云南植膠區(qū)優(yōu)良品種的幼態(tài)微型芽條的培育技術(shù)尚未成熟[4]，尚不能為幼態(tài)芽接無(wú)性系的培育提供足量?jī)?yōu)質(zhì)芽條。因此，培育云南優(yōu)良橡膠樹(shù)品種的幼態(tài)微型芽條已迫在眉睫。

橡膠樹(shù)一直被認(rèn)為是組織培養(yǎng)中難度較大的樹(shù)種之一[5]，且對(duì)基因型的依賴(lài)性大[6]。經(jīng)過(guò)橡膠樹(shù)研究者的多年努力，目前已取較大進(jìn)展[5-6]，在橡膠樹(shù)莖尖及莖段方面亦取得較大成果，1998年，陳雄庭等[7]對(duì)橡膠樹(shù)品種熱研88-13、海墾2、大豐95等花藥植株的微繁進(jìn)行研究，并取得較大進(jìn)展。隨后，趙輝等[8]、鄧柳紅等[9]、孫小龍等[10]、桂明春等[11-12]均對(duì)橡膠樹(shù)莖尖及莖段組織培養(yǎng)進(jìn)行研究，亦取得一定的進(jìn)展。但這些研究多側(cè)重于培養(yǎng)基中激素及培養(yǎng)條件的探索。而未見(jiàn)有關(guān)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分影響的詳細(xì)報(bào)道。據(jù)此，本試驗(yàn)以橡膠樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系‘云研73-477花藥體胚植株的莖段及莖尖為外植體，著重研究MS培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)橡膠樹(shù)幼態(tài)微型芽條培育的影響，以期為培育橡膠樹(shù)幼態(tài)微型芽條提供理論依據(jù)，為橡膠樹(shù)幼態(tài)芽接無(wú)性系的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn) 試驗(yàn)于2015年4～12月在云南省熱帶作物科學(xué)研究所橡膠研究中心進(jìn)行。

1.1.2 材料 以橡膠樹(shù)優(yōu)良無(wú)性系‘云研73-477花藥體胚植株為供試材料。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 數(shù)顯游標(biāo)卡尺（中國(guó)桂林，廣陸牌，精度0.1 mm）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以MS培養(yǎng)基中大量元素（A）、微量元素（B）、有機(jī)成分（C）及鐵鹽（D）為試驗(yàn)因子，忽略因子間交互作用，按L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行，各因子水平及濃度配比見(jiàn)表1、2。額外附加0.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L IBA、0.2 mg/L IAA、0.5 mg/L GA3，60 g/L蔗糖，5.5 g/L瓊脂。

1.2.2 試驗(yàn)方法 按桂明春等[4]報(bào)道的接種方法進(jìn)行接種，3次重復(fù)。每支試管分裝培養(yǎng)基35 mL，用帶有透氣膜的塑料蓋封口，pH值為5.8～6.2。光照時(shí)間為10 h/d，光照強(qiáng)度為1 500 lx，培養(yǎng)溫度為（26±0.5）℃。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)過(guò)程中，每隔1周觀(guān)察芽的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)情況，并作詳細(xì)記錄。培養(yǎng)45 d時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理的有芽外植體節(jié)數(shù)、死亡外植體節(jié)數(shù)及不定芽數(shù)，根據(jù)桂明春等[9]的計(jì)算公式分別算出外植體的死亡率、芽的誘導(dǎo)率及繁殖系數(shù)。并用DPSv7.05版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MS營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)莖段幼態(tài)微型芽條培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)約1周后，部分莖段的腋芽開(kāi)始萌動(dòng)，培養(yǎng)至2周時(shí)，絕大部分莖段的腋芽已萌動(dòng)。繼續(xù)培養(yǎng)，萌動(dòng)芽逐漸伸長(zhǎng)發(fā)育成新芽，新芽進(jìn)一步伸長(zhǎng)發(fā)育成5～8 cm的幼態(tài)微型芽條。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由莖段產(chǎn)生的新生芽有3類(lèi)，I類(lèi)新生芽：一個(gè)葉腋只抽出一個(gè)新芽，芽粗大，發(fā)育良好，能伸長(zhǎng)形成芽條（圖1-A）；II類(lèi)新生芽：一個(gè)葉腋只抽出一個(gè)新芽，發(fā)育較差，嫩葉卷曲，不能進(jìn)一步伸長(zhǎng)發(fā)育成芽條（圖1-B）；III類(lèi)新生芽：一個(gè)葉腋同時(shí)抽出2個(gè)或多個(gè)新芽，只有一個(gè)新芽粗大，發(fā)育良好，能伸長(zhǎng)形成芽條，其余新芽發(fā)育較差，不能發(fā)育成芽條（圖1-C）（圖2）。

表3說(shuō)明，MS營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)莖段幼態(tài)微型芽條培育中各指標(biāo)的影響不同，相對(duì)于誘導(dǎo)率來(lái)說(shuō)，4種成分的影響差異均不顯著；對(duì)于繁殖系數(shù)來(lái)說(shuō)，大量元素、有機(jī)成分及鐵鹽的影響差異達(dá)極顯著水平，微量元素則不顯著；對(duì)于死亡率來(lái)說(shuō)，微量元素、有機(jī)成分及鐵鹽的影響差異達(dá)極顯著水平，大量元素則不顯著。因此，本實(shí)驗(yàn)將繁殖系數(shù)和死亡率作為篩選適合莖段幼態(tài)微型芽條培育的MS培養(yǎng)基成分比例的重要指標(biāo)，現(xiàn)對(duì)兩個(gè)指標(biāo)作進(jìn)一步直觀(guān)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4說(shuō)明，MS培養(yǎng)基各營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)繁殖系數(shù)和外植體死亡率的影響主次順序和優(yōu)水平存在差異。相對(duì)于繁殖系數(shù)而言，因子主次順序?yàn)锳>C>D>B，即大量元素的影響最大，有機(jī)成分次之，微量元素最小，最優(yōu)組合為A1B1C1D1；而對(duì)外植體死亡率來(lái)說(shuō)，因子主次順序?yàn)锽>D>C>A，即微量元素的影響最大，鐵鹽次之，大量元素最小，最優(yōu)組合為A3B2C2D1。

但上述分析并不能得出適合莖段幼態(tài)微型芽條培育適宜MS培養(yǎng)基各成分比例，需對(duì)單個(gè)因子進(jìn)行逐一分析。相對(duì)于D因子來(lái)說(shuō)，繁殖系數(shù)和外植體死亡率的優(yōu)水均是水平1，故D因子的優(yōu)水平是D1；相對(duì)于A(yíng)因子來(lái)說(shuō)，繁殖系數(shù)的優(yōu)水平為A1，外植體死亡率的優(yōu)水平是A3，兩者的優(yōu)水平不一致，但A因子對(duì)繁殖系數(shù)的影響差異達(dá)極顯著水平，而對(duì)死亡率的影響則不顯著（表3），故A因子的優(yōu)水平為A1；同理得B因子和C因子的優(yōu)水平分別為B2、C1。

綜上所述，理論上適合橡膠樹(shù)莖段幼態(tài)微型芽條培育的最優(yōu)組合為A1B2C1D1，即全量大量元素+ 4/5微量元素+全量有機(jī)成分+全量鐵鹽。

2.2 MS營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)莖尖幼態(tài)微型芽條培養(yǎng)的影響

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)所設(shè)的9個(gè)處理中，莖尖的頂芽和葉腋均可萌動(dòng)發(fā)育成新芽，培養(yǎng)過(guò)程中，外植體無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生，均有不定芽產(chǎn)生，誘導(dǎo)率為100%，死亡率為0，且每節(jié)外植體均產(chǎn)生多個(gè)新芽。據(jù)此，將新芽的繁殖系數(shù)作為分析MS營(yíng)養(yǎng)對(duì)莖尖幼態(tài)微型芽條培育的考核指標(biāo)，現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

表5說(shuō)明，MS培養(yǎng)基中大量元素、微量元素及鐵鹽對(duì)繁殖系數(shù)的影響差異達(dá)極顯著水平，有機(jī)成分的影響則不顯著。

由直觀(guān)分析可知（表6），繁殖系數(shù)在組合間存在的差異較大，最高達(dá)6.22倍，最小僅為1.36倍，兩者間的差異極顯著；由極差R值的大小順序可知，4個(gè)因子的主次順序?yàn)锳>D>B>C，即大量元素的影響最大，鐵鹽次之，有機(jī)成分最小，這與方差分析的結(jié)果一致，優(yōu)組合為A3B3C2D1，即2/5大量元素+2/5微量元素+4/5有機(jī)成分+全量鐵鹽。

表6還表明，MS培養(yǎng)基中4個(gè)營(yíng)養(yǎng)成分比例的改變，繁殖系數(shù)的變化存在一定的差異，在試驗(yàn)所設(shè)的范圍內(nèi)，大量元素及微量元素比例的降低，繁殖系數(shù)隨之增加；而有機(jī)成分比例降低時(shí)，繁殖系數(shù)呈先增加后降低趨勢(shì)，當(dāng)有機(jī)成分的比例為4/5時(shí)，繁殖系數(shù)達(dá)最大值（3.23倍），有機(jī)成分增加或降低均會(huì)使繁殖系數(shù)降低；鐵鹽用量的降低，繁殖系數(shù)隨之降低，當(dāng)MS培養(yǎng)基中添加全量鐵鹽時(shí)，繁殖系數(shù)達(dá)最大值（4.17倍）。

3 討論

MS基本培養(yǎng)基是一種在植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用較廣的基質(zhì)配方，是由Murashige 和Skoog于1962 年為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。因其硝酸鹽、鉀離子和銨離子含量較其它培養(yǎng)基豐富，微量元素和有機(jī)成分全面而被廣泛使用[13]。也是橡膠樹(shù)組織培養(yǎng)所通用的培養(yǎng)基。但不同類(lèi)型材料離體培養(yǎng)所需的MS培養(yǎng)基成分比例不同，陳雄庭等[1]認(rèn)為誘導(dǎo)花藥愈傷組織的基本培養(yǎng)基MB的效果比MS好。黃德貴等[14]也認(rèn)為MB的誘導(dǎo)效果較好。譚德冠等[6]認(rèn)為將MS培養(yǎng)基中微量元素增大1倍可大大提高胚狀體的誘導(dǎo)率，將大量元素降至80%，微量元素加倍可提高植株的再生頻率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，分別以體胚植株的莖段和莖尖為外植體培育幼態(tài)微型芽條，兩者所需的MS培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分比例亦不同，前者適宜比例為全量大量元素+4/5微量元素+全量有機(jī)成分+全量鐵鹽；后者適宜比例為2/5大量元素+2/5微量元素+4/5有機(jī)成分+全量鐵鹽。據(jù)此，在橡膠樹(shù)幼態(tài)微型芽條培育中，應(yīng)根據(jù)不同類(lèi)型的材料來(lái)選擇適合的MS培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的比例。

在橡膠樹(shù)幼態(tài)微型芽條培育中，首要解決的問(wèn)題是誘導(dǎo)出具有伸長(zhǎng)能力的新芽，這類(lèi)芽能否誘導(dǎo)成功直接關(guān)系到微型幼態(tài)芽條培育的成敗[4]。本試驗(yàn)所設(shè)的9個(gè)處理中，均有一定數(shù)量的新芽產(chǎn)生，但大部分芽的質(zhì)量較差，不易進(jìn)一步伸長(zhǎng)發(fā)育形成可用芽條，而是在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中逐漸枯萎死亡或從芽的基部長(zhǎng)出許多小芽形成簇生芽，簇生芽不能進(jìn)一步伸長(zhǎng)發(fā)育成可用芽條。由此可見(jiàn)，高質(zhì)量新芽誘導(dǎo)技術(shù)的不成熟已嚴(yán)重制約了橡膠樹(shù)幼態(tài)微型芽條的培育，是目前急需解決的技術(shù)問(wèn)題之一。此外，MS培養(yǎng)基的4種營(yíng)養(yǎng)成分包括多種化學(xué)物質(zhì)，如大量元素包括NH4NO3、KNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4和CaCl2·2H2O或CaCl2。本試驗(yàn)已找出了MS培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)莖尖及莖段微型芽條培育的影響規(guī)律，并篩選出了最佳比例，但對(duì)各營(yíng)養(yǎng)成分中具體化學(xué)物質(zhì)的影響情況未做深入研究。王樹(shù)昌等[15]認(rèn)為微量元素Cu對(duì)橡膠樹(shù)組培培養(yǎng)成胚、生根及組培苗生根有著重要影響。因此，MS培養(yǎng)基中4種營(yíng)養(yǎng)成分種各化學(xué)物質(zhì)對(duì)橡膠樹(shù)幼態(tài)微型芽條培育的影響有待進(jìn)一步研究。

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