鐘淦彬 李維國 位明明 鄭學(xué)項(xiàng) 易曉潔

摘 要 選用178份巴西橡膠樹種質(zhì)材料，采用SSR和AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對巴西橡膠樹種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定，探討2種方法的應(yīng)用效果并加以比較分析。結(jié)果顯示：利用多態(tài)性強(qiáng)的19對SSR引物，檢測到92個等位基因；用25對AFLP引物組，檢測到702條有多態(tài)性的帶。SSR位點(diǎn)的平均多態(tài)性信息量（PIC）值為0.46，而AFLP多態(tài)性帶比例是54.88%，AFLP比SSR分子標(biāo)記具有更高的多態(tài)性。結(jié)果說明，AFLP標(biāo)記比SSR標(biāo)記更適合于巴西橡膠樹種質(zhì)材料的鑒定和保護(hù)，同時進(jìn)一步驗(yàn)證了在作物遺傳資源的研究中，采用多種分子標(biāo)記方法可以獲得更加準(zhǔn)確的研究數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；SSR；AFLP；分析比較

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The 178 rubber tree germplasm resources were identified using SSR and AFLP markers and to explore the application effects of two methods by comparing the result of two markers. The results showed that 19 pairs of SSR primers， total 92 polymorphic fragments were detected； 25 AFLP primer combinations（Ecor I/Mse I）were used， and total 701 polymorphic bands were produced. AFLP was higher polymorphic than SSR. The average of polymorphic information content（PIC）was 0.46 for SSRs. Percentage of polymorphic AFLP bands was 54.88%. According to the comparative result acquired in this study， AFLP is more suitable for rubber tree germplasm materials identification and protection than SSR. Meanwhile further validated that in crop genetic resources research， use more kinds of molecular marker method can obtain more accurate data.

Key words Hevea brasiliensis； SSR； AFLP； Comparative analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.002

20世紀(jì)90年代以來，基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記逐步發(fā)展起來，如SSR、AFLP等，被廣泛應(yīng)用于動植物種質(zhì)資源研究。SSR（Simple Sequence Repeats）簡單重復(fù)序列，最常見是雙核苷酸重復(fù)，由于串聯(lián)數(shù)目的不同產(chǎn)生其高度的多態(tài)性，也稱微衛(wèi)星DNA。SSR檢測所需DNA量少，試驗(yàn)操作簡便，穩(wěn)定性好[1]。AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，1992年荷蘭Keygene公司科學(xué)家Zabeau Mare和Vos Pieter發(fā)明并發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記方法，是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片段。其重復(fù)性強(qiáng)，可靠性好，可信度高，雖然實(shí)驗(yàn)成本較高，但也越來越廣泛地應(yīng)用在遺傳育種研究領(lǐng)域。進(jìn)入21世紀(jì)以來，分子標(biāo)記也逐步被應(yīng)用在橡膠樹種資資源的研究中，Saha等[2]用（hmct5、hmct1、hmac4、hmac5）4個SSR標(biāo)記鑒定了27份橡膠樹種質(zhì)；謝黎黎等[3]用SSR標(biāo)記構(gòu)建了87份橡膠樹材料的DNA指紋圖譜；2007年，王惠君[4]構(gòu)建了橡膠樹初級分子遺傳圖譜；2010年，龍青姨[5]利用EST～SSR標(biāo)記研究橡膠樹栽培種質(zhì)的遺傳多樣性與遺傳分化，鐘淦彬[6]利用AFLP分子標(biāo)記方法構(gòu)建了部分橡膠樹種質(zhì)資源的AFLP指紋圖譜。

本試驗(yàn)選用178份巴西橡膠樹種質(zhì)材料，分別采用SSR標(biāo)記與AFLP標(biāo)記技術(shù)對這些種質(zhì)材料進(jìn)行鑒定，探討2種標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用效果并加以比較分析。其試驗(yàn)結(jié)果可以初探分子標(biāo)記技術(shù)在研究巴西橡膠樹種質(zhì)資源上的作用，理論與實(shí)際應(yīng)用的驗(yàn)證，為進(jìn)一步使用標(biāo)記技術(shù)研究橡膠樹種質(zhì)材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

在海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家橡膠樹種質(zhì)圃中，采摘24號組合[6]淡綠期橡膠樹幼葉， 放入冰壺，帶回實(shí)驗(yàn)室后用清水沖洗吸干，置于超低溫冰箱（-70 ℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采取改良CTAB法進(jìn)行橡膠樹葉片基因組DNA的提取。具體步驟參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[7]。

1.2.2 SSR引物選擇與分析 SSR標(biāo)記所用的19對引物全部來源于Feng等[8-9]，所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

SSR分析參照鄭學(xué)項(xiàng)等[10]的方法。PCR反應(yīng)采用20 μL體系，具體含量：2×Taq Master Mix 3.86 μL；正向引物、反向引物各0.25 μL；DNA模板2.5 μL；去離子水13.14 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，52～57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存20 min。獲得橡膠樹葉片DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

采用8%非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳，電泳緩沖液為1×TBE，100 V恒壓電泳1.5～2 h。電泳結(jié)束后，采用快速銀染法染色，按照張軍等[11]的方法。

1.2.3 AFLP引物選擇與分析 AFLP標(biāo)記所用的25對引物全部來源于鐘淦彬等[6，12]，所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

AFLP分析參照Vos等[13]、王惠君等[14-15]報(bào)道的方法進(jìn)行。提取總DNA，再進(jìn)行酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、以及選擇性擴(kuò)增。最后，使用銀染法對橡膠樹DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測與分析，具體參照陸光遠(yuǎn)等[16]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)整理與分析

把橡膠樹種質(zhì)的電泳譜帶轉(zhuǎn)換成Excel表格數(shù)字模式。電泳譜帶中，在相同的遷移位置上有帶的計(jì)為1，無帶的計(jì)為0，完成1與0的Excel表格，使用軟件編輯器轉(zhuǎn)換形成統(tǒng)計(jì)軟件可以識別的數(shù)據(jù)模塊，SSR標(biāo)記中形成19對引物的數(shù)據(jù)矩陣，AFLP標(biāo)記中形成25對引物的數(shù)據(jù)矩陣，接著采用Ntsys～pc2.lla（NTsys：Nurnerieal Taxonomy and Multivariate Analysis System）軟件[17]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得UPGMA聚類樹狀圖，分別為SSR標(biāo)記UPGMA聚類樹狀圖和AFLP標(biāo)記UPGMA聚類樹狀圖，然后通過這2個聚類樹狀圖進(jìn)行橡膠樹種質(zhì)材料的聚類分析與親緣關(guān)系分析。最后采用Smith等[18]的方法計(jì)算標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性信息量PIC值（Polymorphism information content），即：PIC=1～∑fi2，其中fi2為i位點(diǎn)的基因頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物多態(tài)性分析

2.1.1 SSR分析 引物HBE190對部分橡膠樹種質(zhì)的SSR指紋圖譜見圖1，所用的19對SSR引物擴(kuò)增結(jié)果見表1。

對所有的橡膠樹種質(zhì)材料，應(yīng)用多態(tài)性強(qiáng)的19對引物組合[8～9]進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，獲得了供試材料的SSR指紋圖譜。分析圖譜獲得如下結(jié)果：引物組合多態(tài)信息含量在0.095～0.669之間，多態(tài)性最好的引物是HBE 329，最差的是HBE 090；引物的多態(tài)性條帶數(shù)在2～7之間，平均達(dá)4條，引物HBE 084、HBE 126、HBE 192、HBE 280多態(tài)性條帶數(shù)都有7條。預(yù)期產(chǎn)物大小在100～300 bp，實(shí)測產(chǎn)物大部分在100～300 bp，只有引物HBE 043、HBE 090、HBE 136、HBE 280、HBE 316產(chǎn)物大小在300 bp以上，總體說明引物設(shè)計(jì)較為合理，具有一定的代表性。

2.1.2 AFLP分析 引物SE3-SM6對部分橡膠樹種質(zhì)的AFLP指紋圖譜見圖2，25對引物組合擴(kuò)增的多態(tài)性結(jié)果見表2。

對所有的橡膠樹種質(zhì)材料，應(yīng)用多態(tài)性強(qiáng)的25對引物組合[6，12]進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增，獲得了供試材料的AFLP指紋圖譜。分析圖譜可知：引物組合多態(tài)性在39.22%～81.63%之間，多態(tài)性最好的引物組合是SE7 SM10，最差的是SE9 SM16；引物組合擴(kuò)增的譜帶數(shù)在35～68之間，平均達(dá)52條，SE16 SM14 擴(kuò)增譜帶數(shù)最多，達(dá)68條譜帶；SE13 SM11擴(kuò)增譜帶數(shù)最少，只有35條。所有引物組合共擴(kuò)增出701條多態(tài)性帶，占總擴(kuò)增帶（1 274條帶）的55.02%。

2.2 SSR與AFLP標(biāo)記對供試品種鑒定信息獲取量比較

利用多態(tài)性強(qiáng)的SSR和AFLP引物，分別對所有供試巴西橡膠樹種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果詳見表3。

從SSR引物擴(kuò)增結(jié)果可知：引物HBE 084、HBE 126、HBE 192、HBE 280具有最高多態(tài)性標(biāo)記數(shù)，為7個，引物HBE 014、HBE 017擴(kuò)增出的多態(tài)性標(biāo)記最少，只有2個；4對引物表現(xiàn)出特異性標(biāo)記，可以鑒別其中4份材料；19對SSR引物共擴(kuò)增出92個多態(tài)性標(biāo)記。

從AFLP引物擴(kuò)增圖譜可以看出：SE7 SM10引物組合多態(tài)性最好，擴(kuò)增出40個多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)；引物組合SE3 SM9和SE13 SM11擴(kuò)增的多態(tài)性標(biāo)記最少，只有19個；25對引物組合都表現(xiàn)出特異性標(biāo)記，可以鑒別其中12份材料；25對AFLP引物組合總計(jì)擴(kuò)增出701個多態(tài)性標(biāo)記。

對比2種標(biāo)記方法的擴(kuò)增結(jié)果可知，AFLP多態(tài)性標(biāo)記的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于SSR， AFLP獲得的總標(biāo)記數(shù)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于SSR標(biāo)記；就單引物而言，AFLP揭示的特異性位點(diǎn)明顯多于SSR標(biāo)記。初步表明AFLP標(biāo)記比SSR標(biāo)記更適合于巴西橡膠樹種質(zhì)材料間的鑒別、指紋圖譜分析等微觀系統(tǒng)研究。

2.3 SSR與AFLP標(biāo)記對供試種質(zhì)材料鑒別效率的比較

根據(jù)SSR標(biāo)記對所有供試橡膠樹材料的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析，得到聚類樹狀圖詳見圖3。

根據(jù)AFLP標(biāo)記對所有供試橡膠樹材料的EXCEL表格數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)換為單匹配數(shù)據(jù)矩陣，AFLP聚類分析，獲得親緣關(guān)系樹狀圖，見圖4（UPGMA法）。

2.3.1 AFLP引物組合鑒別橡膠種質(zhì)材料效率分析

25對AFLP引物分別利用NTsys一pc2.lla 軟件進(jìn)行單獨(dú)聚類分析，獲得25個AFLP聚類樹狀圖。通過分析所有樹狀圖可知：各引物組合鑒別的效率不同，引物組合SE7 SM10鑒別效率最強(qiáng)，可以鑒別其中172份材料，鑒別率達(dá)96.62%；其次為引物組合SE4 SM10，可以鑒別165份材料，鑒別率達(dá)87.77%；引物組合SE3 SM6鑒別效率最差，鑒別出87份材料，鑒別率只有46.28%。各引物組合的鑒別效率詳見表4。

從表3和表4分析可知，SSR與AFLP標(biāo)記方法的鑒別效率不同。利用SSR標(biāo)記方法，平均每對引物可以鑒別9.3份材料，單引物最高可以鑒別78份材料，但所有供試材料中有2份材料無法鑒別；利用AFLP標(biāo)記方法，平均每個引物組合可以鑒別7.1份材料，單引物最高可以鑒別172份材料，且可以鑒別所有供試巴西橡膠樹種質(zhì)材料。再結(jié)合AFLP引物組合鑒別效率分析可知，AFLP標(biāo)記比SSR標(biāo)記更適于巴西橡膠樹種質(zhì)資源的鑒定。

3 討論

生物技術(shù)日益發(fā)達(dá)的今天，分子標(biāo)記技術(shù)也在不斷地發(fā)展與豐富。每種分子標(biāo)記方法，其技術(shù)原理、檢測手段都不相同，因此每種標(biāo)記揭示的微觀上遺傳與變異也不相同，穩(wěn)定性與重現(xiàn)性也各不相同，各種標(biāo)記所揭示的遺傳信息量和產(chǎn)出效率也有很大差別。通過本試驗(yàn)對比分析可以看出，在檢測巴西橡膠樹DNA多態(tài)性方面，AFLP比SSR多態(tài)性比率更大，更適合其種質(zhì)資源的鑒定與保護(hù)。

SSR分子標(biāo)記是基于PCR技術(shù)的新一代分子標(biāo)記技術(shù)，其克服了RAPD和RFLP標(biāo)記的不足。SSR多態(tài)性產(chǎn)生的機(jī)制不是單堿基突變或插入缺失造成的，而是因?yàn)镈NA復(fù)制和修復(fù)過程中堿基的錯配、滑動和減數(shù)分裂過程中姊妹染色單體的不均等交換[19]，因而表現(xiàn)出高度的多態(tài)性。Pejic等[20]分析比較研究玉米自交系間的遺傳差異，得到SSR的多態(tài)性信息量是RAPD和RFLP的2倍。AFLP技術(shù)，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性[21]，是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片段，其可通過改變限制性內(nèi)切酶種類和選擇性堿基種類或數(shù)目來調(diào)節(jié)擴(kuò)增的條帶數(shù)，因此具有較強(qiáng)的多態(tài)分辨能力，是一項(xiàng)新的分子標(biāo)記技術(shù)。AFLP技術(shù)檢測效率高，每個AFLP 反應(yīng)能檢出多態(tài)片段很多，信息量很大，并不是因?yàn)槊總€位點(diǎn)具有豐富的等位基因形式[22]，是因?yàn)槠湓谝淮螁蝹€反應(yīng)中可以檢測到大量的片段。本研究SSR標(biāo)記對所有供試材料進(jìn)行聚類分析，但所有供試材料中有2份材料無法鑒別，可能是由于橡膠樹是異花授粉作物，長期存在自然雜交的現(xiàn)象，不僅在品種間存在著遺傳變異，在同一種群內(nèi)也存在遺傳變異，SSR標(biāo)記多態(tài)性還無法完全鑒別所有的供試材料；而AFLP標(biāo)記可以鑒別所有的供試材料，可見AFLP標(biāo)記在橡膠樹種質(zhì)資源的研究中表現(xiàn)出更高的多態(tài)性。本研究SSR標(biāo)記和AFLP標(biāo)記，比較2種標(biāo)記方法獲得的結(jié)果可知，其多態(tài)性結(jié)果與其他作物中表現(xiàn)的情況不盡相同，可能是研究的物種不同，表現(xiàn)出的結(jié)果也不盡相同，有待試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，從本研究比較結(jié)果可以看出，AFLP分子標(biāo)記技術(shù)比SSR更適合于巴西橡膠樹種質(zhì)材料的鑒定和保護(hù)。

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