程漢 陳相 黃華孫

摘 要 前期研究表明，在橡膠樹中存在著1個CBF信號途徑，然而該信號通路的下游COR家族功能基因卻一直未能被發(fā)掘。本研究通過檢索橡膠樹低溫誘導轉錄組數(shù)據(jù)，從中發(fā)現(xiàn)了1個COR47基因。通過對該基因的克隆、測序和生物信息學分析，表明HbCOR47可能是橡膠樹中唯一的COR家族成員。對該基因的低溫誘導表達特性進行研究，發(fā)現(xiàn)HbCOR47受到低溫誘導表達，但反應時間較擬南芥等溫帶植物的COR基因晚。針對HbCOR47基因的特性及其表達特征，結合橡膠樹CBF信號途徑的特征進行了進一步討論。

關鍵詞 橡膠樹；低溫應答；CBF信號途徑；HbCOR47

中圖分類號 Q78；S794.1 文獻標識碼 A

Abstract A CBF pathway was found existed in rubber trees in our previous study， while its downstream functional COR family genes were not identified yet until now. In this study， a COR47 homolog gene was identified by searching the rubber tree cold induced transcriptome data. Then the HbCOR47 gene was cloned， sequenced and bioinformatically analyzed， which was revealed to be the only one COR family member in H. brasiliensis. The expression of HbCOR47 exhibited a cold induced expression profile， while the responding pattern was relatively slow when compared with those in Arabidopsis. Finally， the characterization of HbCOR47 gene and CBF pathway of rubber tree were discussed in the context of non-cold acclimation plants.

Key words Hevea brasiliensis； Cold responding； CBF pathway； HbCOR47

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.013

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是天然橡膠的主要來源。20世紀我國在北緯18°大規(guī)模成功種植巴西橡膠樹，建立了海南、云南和廣東三大植膠區(qū)，基本保障了我國對天然橡膠的需求[1]。然而由于巴西橡膠樹起源于熱帶，對低溫極其敏感，加上我國植膠區(qū)處于熱帶北緣，時常受到冬春寒潮的影響。低溫寒害是限制我國天然橡膠種植的主要環(huán)境限制因子之一。建國后平均每隔10年就會遇到一次大的寒潮，造成橡膠樹大范圍死亡，給廣大膠農和農場帶來巨大的經濟損失，也威脅到我國天然橡膠產業(yè)的發(fā)展[2-3]。因此，抗寒育種始終是我國橡膠樹育種的一個主要研究方向。

開展橡膠樹抗寒生理機制研究，一方面能弄清橡膠樹遭受寒害后的生理學變化，為橡膠樹抗寒栽培提供理論支持；另一方面可以摸清橡膠樹低溫應答信號通路，克隆橡膠樹中與抗寒相關的功能基因。CBF信號通路是近年來在植物中發(fā)現(xiàn)的最重要的低溫信號途徑之一。CBF信號途徑作為非ABA依賴的低溫應答途徑，在溫帶植物應對低溫寒害過程中發(fā)揮了重要的作用。巴西橡膠樹起源于熱帶，對低溫極其敏感。之前程漢等[4]在橡膠樹中克隆了CBF信號途徑中最關鍵的轉錄因子HbCBF1基因，也對該基因的表達特征和生物學功能進行了系統(tǒng)的研究，并推測橡膠樹中也存在著一個基于HbCBF1轉錄因子的CBF信號通路[4-6]。但通過常規(guī)分子生物學方法，筆者一直未能在橡膠樹中克隆到CBF信號通路的下游COR家族功能基因。利用擬南芥COR6.6、COR47、COR15a和RD29a 4個COR家族蛋白序列對橡膠樹低溫誘導轉錄組數(shù)據(jù)進行比對搜索，僅得到1條與AtCOR47同源的序列。本研究旨在對該序列所代表的基因進行初步研究，試圖彌補橡膠樹中CBF信號通路的下游缺口。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗Solexa測序的材料來自巴西橡膠樹抗寒品種93-114，當年嫁接苗保存于中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所苗圃內，待第一蓬葉穩(wěn)定后，搬回實驗室中，放置于人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：25 ℃，16 h光照/8 h黑暗。經過一周適應性培養(yǎng)后，轉移至設置為4℃的低溫培養(yǎng)室進行低溫處理。分別在0，2，8和24 h取樣，提取總RNA，送交北京百邁客生物公司進行轉錄組測序分析。

菌種E. coli. JM109為國家橡膠樹育種中心實驗室保存菌種，Taq酶、pUCm-T載體和DNA凝膠回收試劑盒、AMV逆轉錄酶、T4 DNA連接酶等分子生物學試劑購自大連寶生物公司。所有引物及測序均由廣州英駿生物公司合成完成。其他生化試劑為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 HbCOR47基因的鑒定和序列分析 由于COR家族基因不根據(jù)序列、而根據(jù)其功能和低溫應答特征進行分類。各個COR成員之間沒有序列同源性。為了全面鑒定橡膠樹中的COR家族成員，本實驗使用擬南芥COR6.6、RD29a、COR15a和COR47四個基因的編碼蛋白質序列，分別對橡膠樹低溫誘導轉錄組數(shù)據(jù)進行TBLASTN搜索（e-value<0.01），得到候選COR基因HbCOR47。

HbCOR47基因的ORF預測通過NCBI的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）程序進行，其氨基酸序列理化特性分析通過ExPASy的在線軟件Compute PI/MW（http：//au.expasy. org/tools/pi_tool.html）、Protparam tool（http：//us.expasy.org/tools/protparam.html）、http：//www.ch.embnet.org/和NCBI的核酸、蛋白質結構特征在線分析工具進行。氨基酸功能保守區(qū)通過NCBI的CD-Search service工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）進行預測。信號肽預測采用SignalP 3.0程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）進行。疏水性圖譜使用ExPASy的ProtScale（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）進行。蛋白質跨膜區(qū)預測使用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行。亞細胞定位使用Psort程序（http：//psort.nibb.ac.jp）進行分析。

1.2.2 HbCOR47全長cDNA的克隆 根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)中搜索得到的結果，設計引物：5′-CTTACGG

TGATCTAGAACAGCAT-3′，5′-CTACAAGCCACAC

ACTTATCATCAT-3′，以擴增HbCOR47基因全長序列。分別從cDNA和基因組DNA上擴增目的片段，回收后克隆至T載體，送交廣州英駿公司測序。將測序結果與轉錄組中的序列進行比對，證實擴增到的序列來自HbCOR47基因。

1.2.3 基因結構與進化分析 利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對HbCOR47外顯子/內含子組織結構進行分析。利用MEGA軟件對橡膠樹和其他植物的HbCOR47蛋白的氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]，采用Neighbor-Joining方法，進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學檢驗。

1.2.4 基因的表達模式分析 基因表達采用qPCR方法進行。橡膠樹抗寒品種93-114幼苗經過0，0.5，2，8和24 h的低溫處理，提取葉片總RNA，經過DnaseI消化、反轉錄后，進行qPCR分析，以橡膠樹18S rRNA基因為內參，采用ΔΔct法進行定量分析。HbCOR47的qPCR引物為5′-TCGTGGGTTGTTTGGTTTCTTGGG-3′，5′-CTCT

TTGTGCTCAGGTTCAGATACG-3′。每個樣品經過3個生物學重復和3個實驗學重復，確保實驗數(shù)據(jù)的一致性。表達數(shù)據(jù)經過student t-test進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 HbCOR47基因的鑒定和序列特征分析

通過同源性搜索，在橡膠樹低溫誘導轉錄組數(shù)據(jù)中查詢到唯一一個與擬南芥COR47蛋白具有相似性的序列。經過進一步電子延伸，得到1條1 112 bp的cDNA序列，經過編碼區(qū)查找，發(fā)現(xiàn)其中有1個編碼224 Aa的蛋白質編碼區(qū)。HbCOR47的cDNA序列和推導的編碼區(qū)氨基酸序列如圖1所示。經過初步分析，發(fā)現(xiàn)在HbCOR47基因推導的多肽序列上，有1個明顯的脫水蛋白結構域（dehydrin domain），該結構域是COR47蛋白的典型特征[8]，因此推測該多肽與COR47具有同源性，故將該序列所對應的基因初步命名為HbCOR47。

根據(jù)HbCOR47電子延伸序列，從橡膠樹cDNA中擴增目標序列，結果得到1個1.2 kb左右的DNA片段（圖2），將該片段從瓊脂糖凝膠中回收、克隆，送交測序。結果表明該DNA片段的序列與電子延伸的HbCOR47序列完全一致，表明從橡膠樹低溫誘導轉錄組數(shù)據(jù)中得到的HbCOR47基因是存在的，且序列正確。

2.2 HbCOR47基因結構分析

利用HbCOR47的全長cDNA序列，搜索橡膠樹參考基因組序列，得到該基因的上游調控序列元件和基因結構信息。如圖3所示，HbCOR47基因包含2個外顯子和1個104 bp的內含子，該內含子存在于編碼區(qū)內部。檢索該基因的上游調控序列，還發(fā)現(xiàn)分別在-1 500 bp，-670 bp和-500 bp的位置存在著CRT/DRE轉錄調控元件（圖3）。由于CRT/DRE元件可與CBF蛋白AP2 domain特異性地結合， 啟動耐寒基因COR的表達[9]，推測HbCOR47基因可能是CBF信號途徑下游基因，受到CBF轉錄因子的調控。

2.3 HbCOR47編碼多肽序列特征分析

利用EMBOSS的PEPSTATS 工具對推導的HbCOR47蛋白進行初步分析，發(fā)現(xiàn)該推導多肽分子量為25.4 ku，等電點為5.275 6。富含賴氨酸殘基，達到44個，占總氨基酸殘基數(shù)目的19.64%。通過SignalP 3.0程序和ProtScale（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）對HbCOR47進行信號肽和疏水區(qū)搜索，發(fā)現(xiàn)該蛋白的N端不存在明顯的信號肽，也沒有明顯的跨膜區(qū)域。用Psort程序（http：//psort.hgc.jp）分析HbCOR47蛋白的亞細胞定位，結果顯示在第94個氨基酸殘基位置有一個KKKKKE

KKGLKEKIKEK的Robbins & Dingwall核定位序列[10]，表明該蛋白有較高可能性（0.973）定位在細胞核中。同時，該蛋白還有可能定位到葉綠體，主要存在于基質、類囊體膜和間隙中（表1）。

筆者也利用擬南芥的COR47蛋白進行了亞細胞定位分析。結果表明，AtCOR47蛋白的亞細胞定位不同于橡膠樹，而是定位在細胞核、線粒體和溶酶體中。通過對比橡膠樹和擬南芥的COR47定位結果，發(fā)現(xiàn)橡膠樹COR47有更大的可能性定位到細胞核中，這個分值甚至比擬南芥COR47的定位分值還要高很多（表1）。

2.4 HbCOR47蛋白的進化分析

將橡膠樹HbCOR47基因編碼多肽序列與來自擬南芥（P31168.2）、楊樹（XP_006383759.1）、蓖麻（XP_

002510636.1）、木薯（AGC51777.1）、可可（XP_007017965.1）、大豆（NP_001240106.1）、樟樹（XP_006829002.1）等其他植物的COR47基因編碼蛋白序列進行比對，發(fā)現(xiàn)橡膠樹HbCOR47蛋白與其他植物的COR47蛋白具有較高的相似性（圖4）。在比對中也發(fā)現(xiàn)，COR47家族蛋白中存在著數(shù)個高度保守的結構域，其中包括核定位特征序列（128～150）和脫水蛋白家族結構域（240～273）。

對橡膠樹和其他7種植物的COR47蛋白質氨基酸序列一起構建系統(tǒng)進化樹，結果表明橡膠樹的COR47蛋白與同樣來自大戟科的蓖麻和木薯親緣關系較近，而與擬南芥和樟樹則關系較遠（圖5）。

2.5 HbCOR47基因表達特征分析

COR47基因是CBF信號通路下游的功能基因之一，其啟動子區(qū)域含有CRT/DRE結合元件，受到CBF轉錄因子的調控[11-14]，因而受低溫誘導表達。為了檢測橡膠樹HbCOR47基因是否具有低溫應答特征，利用qPCR技術對橡膠樹HbCOR47基因的表達模式進行了研究。結果如圖6所示?？梢姡琀bCOR47基因在常溫下表達水平極低，在低溫處理前4 h內，幾乎看不出表達量的上升。到第8小時，HbCOR47基因表達量幾乎上升了1倍，達到極顯著差異水平。隨著低溫處理時間的延長，HbCOR47的表達量還在進一步上升。HbCOR47基因表現(xiàn)出了典型的低溫誘導表達特征，表明該基因作為CBF信號通路下游功能基因的同源基因，參與了橡膠樹低溫應答途徑。

3 討論

CBF信號通路包括CBF轉錄因子家族成員和下游的COR家族功能基因，構成一個完整的低溫應答反應機制。然而在非低溫馴化植物中，雖然發(fā)現(xiàn)了CBF家族基因，但對其下游的COR家族成員研究較少。筆者也曾經在橡膠樹中克隆了CBF家族基因，但一直未能發(fā)現(xiàn)其下游功能基因。在本研究中，筆者通過深度轉錄組測序技術，從橡膠樹中發(fā)現(xiàn)并克隆、分析了可能唯一的COR家族成員，并研究其特性及其低溫應答特征。該研究對于進一步闡述橡膠樹的低溫應答機制、特別是其CBF信號通路的功能具有重要意義。

經過研究，發(fā)現(xiàn)HbCOR47蛋白與擬南芥、楊樹等其他植物中的COR47蛋白同源，也含有一個脫水蛋白結構域和一個細胞核定位特征序列。需要指出的是，通過生物信息學方法分析HbCOR47蛋白的亞細胞定位，卻發(fā)現(xiàn)該蛋白非常有可能定位到細胞核中。這是之前的研究中沒有發(fā)現(xiàn)過的。COR47蛋白含有脫水蛋白（dehydrin）結構域，屬于脫水蛋白家族。脫水蛋白作為干旱和低溫應答蛋白，在植物細胞受到非生物脅迫時，起到保護細胞的膜系統(tǒng)的作用。由于COR47蛋白不是轉錄因子，也沒有轉錄結合調控結構域，因此推測HbCOR47蛋白定位到細胞核與保護橡膠樹細胞核的膜系統(tǒng)有關。但由于對COR47蛋白生物學功能的研究較少，需要更多的分子生物學和結構生物學的證據(jù)才能支持該推論。

筆者之前的研究中證明了橡膠樹HbCBF1蛋白具有體外結合CRT/DRE結合元件的功能[4-5]，表明在橡膠樹中也存在CBF信號途徑，然而由于未能發(fā)現(xiàn)下游的COR家族基因，因而推測橡膠樹的CBF信號途徑是不完善的。本研究中通過搜索RNA-seq數(shù)據(jù)，找到一個COR47同源基因，同時也證明該基因是低溫應答基因。表明橡膠樹中也存在CBF下游基因。然而，與擬南芥等溫帶植物不同的是，在擬南芥中至少存在8個COR家族蛋白[14]，在橡膠樹卻只找到一個COR47蛋白，在數(shù)量上比擬南芥少了很多。此外，在之前的研究中，筆者克隆了橡膠樹的HbCBF1基因，也證明了該基因具有調控CRT/DRE轉錄調控元件的作用。COR47作為CBF的下游功能基因，它對低溫應答往往要比CBF基因慢。在擬南芥中，CBF1基因受低溫誘導15 min后即可表達，而COR47則要等到2 h之后[15-17]。在橡膠樹中，筆者發(fā)現(xiàn)HbCBF1基因在低溫處理4 h后才開始誘導表達，而HbCOR47則在低溫處理8 h后才開始進行低溫響應。橡膠樹的CBF1和COR47蛋白的低溫應答時間明顯比擬南芥晚很多，表明橡膠樹CBF信號途徑對低溫反應相對遲鈍。這兩個因素可能決定了橡膠樹中的CBF信號途徑在橡膠樹的低溫應答方面功能較弱，這也許也是橡膠樹對低溫敏感的原因之一。

當然，本研究僅僅對橡膠樹COR47基因進行了初步研究，目前也只能推測HbCOR47是HbCBF1的下游基因。這些推論還需要進一步的實驗證明。未來研究將著重從COR47的生理功能和HbCBF1對HbCOR47的調控作用方面開展，努力揭示橡膠樹CBF信號途徑的應答狀態(tài)和生理功能。

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