郭強(qiáng) 崔一平 徐世強(qiáng) 張木清

摘 要 為探討甘蔗梢腐病病原菌菌株的群體結(jié)構(gòu)及種內(nèi)的分化，以采自廣西、云南、福建和海南等不同地區(qū)的30個(gè)甘蔗梢腐病菌株為材料，通過初步的分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)30個(gè)甘蔗梢腐病菌株分屬于2個(gè)不同的病原種。利用KClO3培養(yǎng)基誘導(dǎo)篩選獲得Nit突變體，其中1個(gè)菌株沒有產(chǎn)生Nit突變體，剩下的29個(gè)菌株共產(chǎn)生266個(gè)Nit突變體。營養(yǎng)體親和群的測(cè)定結(jié)果表明：9個(gè)菌株的VCG沒有同一性，1個(gè)菌株組成1個(gè)VCG；不同地理來源的甘蔗梢腐病菌株間互不親和，分屬于不同的VCG；同一地理來源的甘蔗梢腐病菌株間亦不親和；暗示引起甘蔗梢腐病的串珠鐮刀菌屬群體內(nèi)存在豐富的VCG多樣性，在不同的栽種地區(qū)群體結(jié)構(gòu)變化很大，并且營養(yǎng)體親和性與菌株的地理來源及寄主品種都沒有明顯的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 甘蔗梢腐病；串珠鐮刀菌；Nit突變體；營養(yǎng)體親和群

中圖分類號(hào) S432.44 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Sugarcane pokkah boeng disease has become an important disease in china. In order to analysis the population structure and the genetic differentiation in species of the pathogen. The 30 strains of Fusarium moniliforme were collected individually from the pokkah boeng samples in Guangxi， Yunan， Fujian and Hainan provinces in China. Based on the molecular biology analysis， 30 isolateds divide into two species. After single spore isolation， 266 nitrate-nonutilizing（Nit）mutants were got from 29 strains after these colony transplanted on potato sucrose agar medium with 1.5% KClO3（KPS）； 1 strains can't produce nit mutant. Furthermore， vegetative compatibility of these strains were analyzed on MM plates. In this study， the results show that all of the 9 isolates don't have VCG with each other，or 1 strains correspond to 1 VCG. This phenomenon occur not only in the strains from different geographic origins but also in the strains from the different host varieties in the same geographic origins. All these results indicate there was abundant diversity of VCG in the population of F. moniliforme， and there was no obvious correlation between the vegetative compatibility and geographic origins or host varieties.

Key words Sugarcane Pokkah Boeng Disease； Fusarium moniliforme； Nit mutant； Vegetative compatibility groups

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.017

真菌營養(yǎng)體親和性（Vegetative compatibility）又稱體細(xì)胞親和性（Somatic compatibility），是指真菌菌株間菌絲能融合并交換細(xì)胞質(zhì)或核物質(zhì)的特性；根據(jù)營養(yǎng)體親和性劃分的群體稱為營養(yǎng)體親和群（Vegetative compatibility group， VCG）[1-2]。自1923年Cayley等[3]首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)了植物病原真菌營養(yǎng)體親和與不親和現(xiàn)象。目前，VCG已經(jīng)逐漸成為研究病原真菌遺傳變異、種群地理分布、生理小種鑒定等重要手段[4-5]。在中國，VCG方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用在栗疫病、黃瓜枯萎病、向日葵黃萎病和水稻紋枯病等病原菌的分類上[6-9]。而涉及串珠鐮刀菌屬真菌的研究則較少，有關(guān)甘蔗梢腐病病原菌的營養(yǎng)體親和性研究尚未見報(bào)道。

甘蔗梢腐病是甘蔗上一種重要的真菌病害，對(duì)甘蔗生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。近年來，甘蔗梢腐病在中國廣西、云南、福建以及海南等蔗區(qū)呈現(xiàn)出逐漸加重的趨勢(shì)。過去的研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗梢腐病主要發(fā)生在高溫多濕的夏季，病原菌主要屬于F.verticillioides[12]。本實(shí)驗(yàn)室在冬季進(jìn)行田間調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，冬季的甘蔗上也出現(xiàn)了梢腐病的危害；通過分離鑒定發(fā)現(xiàn)引起冬季梢腐病的病原菌屬于F. proliferatum[12]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)同一病原小種在不同的甘蔗品種上的危害性也不同。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，除了品種抗感性不同外，還有可能是病原種內(nèi)也存在著分化現(xiàn)象。為了進(jìn)一步解析這種現(xiàn)象，同時(shí)對(duì)新發(fā)現(xiàn)的甘蔗梢腐病病原種F. proliferatum與F.verticillioides是否具有營養(yǎng)體親和性進(jìn)行進(jìn)一步的研究。本文期望通過甘蔗梢腐病菌株?duì)I養(yǎng)體親和性的研究，旨在明確同一地理位置不同甘蔗品種以及不同地理來源的甘蔗梢腐病菌的營養(yǎng)體親和群和病原菌群體內(nèi)的VCG結(jié)構(gòu)，探索甘蔗梢腐病菌的種內(nèi)分化、病害流行規(guī)律，更好地了解其種群組成，為甘蔗梢腐病菌遺傳變異的機(jī)制研究提供參考，并為其綜合治理和抗病育種研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 30個(gè)供試菌株（Fusarium moniliforme）于2013～2015年期間分別采集于廣西、云南、福建、海南等地，經(jīng)單孢分離鑒定后獲得（表1）。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基及其組成成分見表2。

1.2 方法

1.2.1 Nit突變體誘導(dǎo) 將供試菌株接種于PDA平板上，于28 ℃培養(yǎng)箱中活化4 d。挑取活化好的菌落邊緣直徑約5 mm的菌塊，轉(zhuǎn)接于KPS（1.5%KClO3）培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿接一塊，每個(gè)菌株5個(gè)重復(fù)，于28 ℃恒溫暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落生長情況。若形成不規(guī)則菌落（非放射狀菌落或扇形角變區(qū)），則為抗氯酸鹽突變體。

在不規(guī)則菌落的不同突變區(qū)挑取菌落邊緣的幼嫩菌絲轉(zhuǎn)接于MM培養(yǎng)基中，野生型菌株作為陰性對(duì)照。于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長情況。若產(chǎn)生氣生菌絲，則說明其為抗氯酸鹽突變體，而未形成硝酸鹽利用缺陷型突變體，應(yīng)將其丟棄。若不產(chǎn)生氣生菌絲或菌落很稀薄，說明形成了硝酸鹽利用缺陷型突變體，即Nit突變體，應(yīng)將其轉(zhuǎn)入MM斜面，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Nit突變體穩(wěn)定性鑒定 將獲得的Nit突變體轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，挑取菌落邊緣的幼嫩菌絲轉(zhuǎn)接于MM培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，并觀察其生長情況。若產(chǎn)生氣生菌絲，則說明Nit突變體不穩(wěn)定，應(yīng)將其丟棄。若仍不產(chǎn)生氣生菌絲或菌落很稀薄，則說明形成了穩(wěn)定的Nit突變體，應(yīng)將其轉(zhuǎn)入MM斜面，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Nit突變體生理表現(xiàn)型鑒別 將穩(wěn)定的Nit突變體分別轉(zhuǎn)接于MM（硝酸鈉為唯一氮源）、NM（亞硝酸鈉為唯一氮源）和HM（次黃嘌呤為唯一氮源）3種培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。根據(jù)菌落生長情況將Nit突變體劃分為4種生理表型；在MM培養(yǎng)基中不產(chǎn)生氣生菌絲或菌落很稀薄，而在NM和HM培養(yǎng)基中均能正常生長的的突變菌株為Nit1；在MM和HM培養(yǎng)基中不能生長或菌落很稀薄，而在NM培養(yǎng)基中能正常生長的突變菌株為NitM；在MM和NM培養(yǎng)基中不能生長或菌落很稀薄，而在HM培養(yǎng)基中能正常生長的突變菌株為Nit3；在MM、NM和HM三種培養(yǎng)基中均不能生長或菌落很稀薄的突變菌株為Nit4（圖1）。

1.2.4 Nit突變體異核體自身親和性測(cè)定 挑取NitM突變體菌落邊緣的幼嫩菌絲直徑約5 mm的菌塊，放置于MM培養(yǎng)基中間，周圍等近距離放置同一菌株的Nit1和Nit3突變體，進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)實(shí)驗(yàn)，兩菌株間距2 cm，每平板放置4～6個(gè)菌株，于28 ℃恒溫暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d。若在NitM與Nit1或Nit3突變菌株菌落交界處出現(xiàn)野生型生長，形成一條濃密的氣生菌絲帶，則說明該菌株具有異核體自身親和性（HSC）。反之，若菌株間沒有形成明顯的氣生菌絲帶，只有稀薄的菌絲，則為異核體自身不親和性（HSI）。

1.2.5 營養(yǎng)體親和群（VCG）的測(cè)定 根據(jù)異核體自身親和性鑒定結(jié)果，各菌株分別選取2～3株具有強(qiáng)親和力的NitM突變體，挑取其菌落邊緣的幼嫩菌絲直徑約5 mm的菌塊，放置于MM培養(yǎng)基中間，周圍等近距離放置不同菌株的Nit1和Nit3突變體，進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)培養(yǎng)，兩株菌間距2 cm，每平板接4～6個(gè)菌株，于28 ℃恒溫暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d。若在NitM與Nit1或Nit3突變菌株菌落交界處出現(xiàn)野生型生長，形成一條濃密的氣生菌絲帶，則說明這兩個(gè)菌株屬于同一營養(yǎng)體親和群（VCG）；若菌絲交界處沒有形成氣生菌絲帶，則兩菌株不屬于同一個(gè)營養(yǎng)體親和群（VCG）。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗梢腐病菌Nit突變體的篩選與鑒定

甘蔗梢腐病菌在PDA培養(yǎng)基上活化4 d后，移入KPS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)；菌株在KPS培養(yǎng)基中1～2 d內(nèi)基本不生長，受到了嚴(yán)重的抑制；第4天開始出現(xiàn)菌絲的緩慢生長，第5天在菌落的一側(cè)出現(xiàn)旺盛的氣生菌絲生長，形成扇形角變區(qū)（圖2-A），即抗氯酸鹽突變體。這些抗氯酸鹽突變體轉(zhuǎn)移到MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其菌落形態(tài)和顏色較野生型菌株在PDA培養(yǎng)基上有較大差異；在MM培養(yǎng)基上，菌絲呈無色、匍匐狀生長，無氣生菌絲生成，生長速度與野生型菌株在PDA上的生長速度大致相近，說明該菌株不能利用硝酸鹽，即為Nit突變體。一些抗氯酸鹽突變體在MM培養(yǎng)基上仍以野生型生長，說明該菌株即抗氯酸鹽，又能利用硝酸鹽，不屬于Nit突變體。

將獲得的Nit突變體轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后，再回接于MM培養(yǎng)基。Nit突變體中絕大部分仍不產(chǎn)生氣生菌絲或菌落很稀薄，即保持了Nit突變體的生長特征，但也有少數(shù)Nit突變體在MM培養(yǎng)基中恢復(fù)了野生型生長，即為不穩(wěn)定的Nit突變體。由此可見，絕大部分Nit突變體是穩(wěn)定的，只有小部分Nit突變體不穩(wěn)定。

30個(gè)供試的甘蔗梢腐病菌株只有YN32未獲得Nit突變體，其余的菌株均獲得了Nit突變體。依據(jù)Nit突變體在MM、NM和HM 3種培養(yǎng)基上的生長特征，可將Nit突變體分為Nit1、NitM、Nit3和Nit4共4種類型的突變體（圖1）。其中大部分為Nit1突變體，占到了總突變體數(shù)的80%以上，其余3種類型的突變體較少；Nit1、NitM、Nit3和Nit4分別占突變體總數(shù)的86.09%、7.89%、5.26%和0.75%（表3）。

2.2 Nit突變體異核體自身親和性測(cè)定

30個(gè)供試菌株中只有9個(gè)菌株獲得了NitM突變體（表3），對(duì)這9個(gè)菌株進(jìn)行異核體自身親和性鑒定，即菌株自身的NitM與Nit1或Nit3配對(duì)培養(yǎng)。結(jié)果顯示，9個(gè)菌株均能發(fā)生營養(yǎng)體自身親和，即兩稀疏生長的菌落交界處形成旺盛的氣生菌絲帶，這表明9個(gè)菌株都具有異核體自身親和性（圖2-B）；而其余菌株未獲得NitM突變體，未能進(jìn)行自身親和性測(cè)定。

2.3 甘蔗梢腐病菌營養(yǎng)體親和群的劃分

由于只有GX4、GX18、GX17、GX31、GX6-2、YN41、YN49、FJ9和FJ64等9個(gè)菌株獲得了NitM突變體，所以只能利用這9個(gè)菌株進(jìn)行菌株間的互補(bǔ)配對(duì)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表4），來源于廣西的GX4、GX18、GX17、GX31、GX6-2，云南的YN41和YN49，福建的FJ9和FJ64分別與不同地區(qū)的其他菌株進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)實(shí)驗(yàn)，均未發(fā)生營養(yǎng)體親和性，說明它們分屬于不同的VCG；同一地區(qū)內(nèi)不同區(qū)域來源的菌株間進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)實(shí)驗(yàn)，亦未發(fā)生營養(yǎng)體親和性，其中廣西區(qū)內(nèi)的柳州、河池和百色區(qū)域的菌株均獲得了NitM突變體，可進(jìn)行不同區(qū)域內(nèi)的菌株間的互補(bǔ)配對(duì)實(shí)驗(yàn)，但均未發(fā)生營養(yǎng)體親和性，說明不同區(qū)域內(nèi)的菌株來自于不同的VCG；有趣的是，同一區(qū)域內(nèi)的不同菌株間，同樣沒有發(fā)生營養(yǎng)體親和性。由此可見，甘蔗梢腐病菌基本上為1個(gè)菌株組成1個(gè)VCG，也就是說甘蔗梢腐病菌的VCG基本上沒有同一性。

3 討論

串珠鐮刀菌引起的甘蔗梢腐病對(duì)甘蔗生產(chǎn)造成了重大的損失，本文利用營養(yǎng)體親和性方法解釋了串珠鐮刀菌內(nèi)一定程度的群體結(jié)構(gòu)。過去的研究表明，營養(yǎng)體親和性與菌株生長的環(huán)境有一定的關(guān)系，特別是培養(yǎng)基的pH[6]。本文中培養(yǎng)30個(gè)菌株所使用培養(yǎng)基的pH一致，所以可以排除環(huán)境因素，僅就菌株本身的營養(yǎng)親和性進(jìn)行說明。本研究利用KClO3對(duì)甘蔗梢腐病菌株進(jìn)行誘導(dǎo)突變，獲得Nit突變體，并通過在不同營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上的篩選確定突變體的類型（Nit1、NitM、Nit3和Nit4），進(jìn)而對(duì)甘蔗梢腐病菌株進(jìn)行營養(yǎng)親和性研究。其中，NitM突變體具有較強(qiáng)的親和能力，而Nit1和Nit3的親和能力較弱[13]；研究發(fā)現(xiàn)，菌株與自身的NitM都具有非常強(qiáng)的親和能力，而少數(shù)幾個(gè)菌株的Nit1和Nit3也具有一定的親和能力。

較早的研究報(bào)道[14-15]認(rèn)為，菌株間的親緣關(guān)系取決于地理分布，來源于相同或相鄰地區(qū)的菌株具有更大的遺傳相似性。但據(jù)潘月梅[16]、余霞等[17]的研究表明，VCG與地理分布間并不存在明顯的關(guān)系，同一地域可能存在多個(gè) VCG或同一VCG分布于多個(gè)地理區(qū)域；同時(shí)Sidhu[18]、Klittich[19]、潘月梅等[16]的研究也表明，串珠鐮刀菌的田間群體結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜。本研究中，分離自廣西、云南、福建和海南等4個(gè)地區(qū)的30個(gè)梢腐病菌株群體間的VCGs互不相同，沒有屬于同一個(gè)VCG的菌株，同時(shí)存在于4個(gè)地區(qū)或其中2個(gè)或3個(gè)地區(qū)的群體中；而來自于同一地區(qū)的甘蔗梢腐病菌株亦未發(fā)現(xiàn)相同的VCG。說明引起甘蔗梢腐病的串珠鐮刀菌群體內(nèi)存在豐富的VCG多樣性，田間群體結(jié)構(gòu)變化很大；同時(shí)也證明VCG與菌株的地理來源并沒有明顯的直接關(guān)系

據(jù)Elena等[20]的研究結(jié)果表明，同一地理區(qū)域中同一寄主品種的菌株通常為同一VCG群。本研究中，除部分菌株未能確定寄主品種外，同一地理區(qū)域的供試菌株幾乎采自不同的甘蔗品種，只有2對(duì)菌株采自相同的甘蔗品種，即YN5和YN32采自粵糖60，YN46和YN67采自ROC22；但由于本研究中YN46和YN67菌株沒有獲得NitM突變體，未能進(jìn)行親和性實(shí)驗(yàn)，所以不能確定它們是否屬于同一個(gè)VCG。但是本研究中發(fā)現(xiàn)采自同一地區(qū)不同甘蔗品種上的甘蔗梢腐病菌株沒有出現(xiàn)營養(yǎng)體親和的現(xiàn)象，說明營養(yǎng)體親和性與寄主品種也沒有相關(guān)性。

本文共分析了30個(gè)甘蔗梢腐病菌株，初步表明該群體內(nèi)存在豐富的VCG多樣性，但由于樣品的局限性，沒有對(duì)不同地理區(qū)域的串珠鐮刀菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)的分析和總結(jié)。在以后的研究中需要采集更多地理區(qū)域，更多甘蔗品種上的梢腐病菌株進(jìn)行分析，以便更全面地分析甘蔗梢腐病菌的VCGs多樣性狀況以及VCG與菌株地理來源以及寄主品種之間的相互聯(lián)系。同時(shí)由于在研究串珠鐮刀菌營養(yǎng)體親和方面沒有成熟的技術(shù)可以借鑒，本研究也存在著一定的不足，雖然30個(gè)菌株幾乎都能夠獲得nit突變體，但是在獲得NitM突變體的篩選概率上偏低，仍需對(duì)該病原菌菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

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