李楊 李河 周國(guó)英 蔣越西 劉君昂

摘 要 為了弄清海南省不同油茶炭疽病菌致病力差異及生物學(xué)特性，采用刺傷接種法對(duì)3種油茶炭疽病菌（C. fructicola、C. siamense、C. camelliae）的致病力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同病原間致病力存在顯著差異，其中C. fructicola致病力最強(qiáng)，C. siamense致病力次之，C. camelliae致病力最弱。對(duì)3種炭疽病菌生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，3種病菌最適生長(zhǎng)溫度、pH值及光照條件類似，同時(shí)均可利用多種碳、氮源，但不同病菌生長(zhǎng)的最優(yōu)碳源、氮源有一定差異。C. fructicola的產(chǎn)孢量、分生孢子萌發(fā)率及附著胞形成率均高于C. siamense及C. camelliae。不同油茶炭疽病菌生物學(xué)特性的差異可能與其致病力分化有關(guān)。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究不同油茶炭疽病菌致病差異機(jī)制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 油茶；炭疽病菌；致病力；生物學(xué)特性；分生孢子萌發(fā)；附著胞形成

中圖分類號(hào) S794.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To clarify the virulence and biological characteristics of pathogens causing Camellia oleifera anthracnose in Hainan Province， wound inoculation was used to investigate the virulence of the three pathogens （Colletotrichum fructicola， C. siamense and C. camelliae） on C. oleifera. Significant difference was found in the virulence among the three pathogens. C. fructicola showed the strongest virulence to C. oleifera followed by C. siamense and C. camelliae in sequence. Biological characteristics of the three pathogens were investigated. It was similar on optimum temperatures， pH values and lights for the growth of the pathogens. These pathogens could utilize different kinds of carbon and nitrogen sources， but the optimum carbon and nitrogen sources for the growth of the pathogens were different from each other. C. fructicola had higher performance in sporulation， conidial germination and appressorial formation， compared with C. siamense and C. camelliae. The difference in the biological characteristics of the pathogens may be associated with their differentiated virulence. The results would provide a theoretical basis for further study of the pathogenic mechanism of the pathogens causing C. oleifera anthracnose.

Key words Camellia oleifera；Anthracnose pathogen；Virulence；Biological characteristic；Conidial germination； Appressorial formation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.018

炭疽病是油茶最重要的病害之一，由炭疽屬（Colletotrichum Corda）真菌引起，導(dǎo)致油茶落葉、落果，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。許多研究認(rèn)為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是引起油茶炭疽病的病原菌[1-5]。目前研究表明，膠孢炭疽菌是由炭疽屬真菌中的許多種組成的復(fù)合種，Weir等[6]利用多基因譜系方法將膠孢炭疽菌復(fù)合種劃分成22個(gè)種和1個(gè)亞種。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，引起油茶炭疽病的病原不止一種，李河等[7-8]利用ITS-CAL-GAPDH 3基因序列聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)果生刺盤(pán)孢菌（C. fructicola）和暹邏刺盤(pán)孢菌（C. siamense）也是油茶炭疽病的致病菌。為了有效防治油茶炭疽病，國(guó)內(nèi)學(xué)者在油茶炭疽病原的鑒定[9]、生物防治[10]、品種抗性[11]等方面取得了一定的研究進(jìn)展，但是不同油茶炭疽病菌在致病力分化、生物學(xué)特性等方面的比較研究未見(jiàn)報(bào)道。研究不同病菌致病力分化及生物學(xué)特性可為有效地、針對(duì)性地防治油茶炭疽病和抗病育種提供理論依據(jù)。

油茶是海南島傳統(tǒng)油料樹(shù)種，在海南省內(nèi)分布廣泛，且栽培面積不斷增加。海南省高溫高濕的氣候條件使得油茶炭疽病在島內(nèi)普遍發(fā)生，危害日益嚴(yán)重。筆者從海南省4個(gè)油茶林中分離鑒定了3種油茶炭疽病菌，并對(duì)其致病力及生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究，目的是闡明不同油茶炭疽病菌致病力差異，同時(shí)初步研究病原菌致病力與其生物學(xué)特性之間是否相關(guān)，旨在為進(jìn)一步揭示油茶炭疽病菌致病力分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

油茶炭疽病葉樣品采自海南省南圣鎮(zhèn)、通什鎮(zhèn)、楓木林場(chǎng)及澄邁林場(chǎng)4個(gè)樣地，病原菌通過(guò)組織分離法，并經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證以及綜合病菌形態(tài)、多基因序列分析鑒定為炭疽病菌[12]，菌株分離地、數(shù)量等信息見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 致病力測(cè)定 每個(gè)采樣地每種油茶炭疽病菌隨機(jī)選取1株菌株，采用離體葉片接種進(jìn)行致病力測(cè)定。方法如下：無(wú)菌水配制3種油茶炭疽病菌分生孢子懸浮液（1×105個(gè)/mL）。選取健康、大小一致的2年生“湘林1號(hào)”油茶葉片作為接種對(duì)象，用75%酒精將葉片消毒30 s，再用無(wú)菌水將葉片清洗3次后晾干，使用一次性注射器針頭將葉片背面表皮挑破但不刺穿，移液器滴加20 μL孢子懸浮液于傷口處，以滴加等量無(wú)菌水作為對(duì)照。每菌株接種10張葉片，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，葉片放置鋪有濕潤(rùn)脫脂棉的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。葉片產(chǎn)生癥狀后，對(duì)油茶葉片進(jìn)行病情分級(jí)。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)為不發(fā)??；1級(jí)（0<病斑直徑≤2 mm）； 2級(jí)（2 mm<病斑直徑≤5 mm）； 3級(jí)（5 mm<病斑直徑≤10 mm）； 4級(jí)（10 mm<病斑直徑≤15 mm）； 5級(jí)（病斑直徑>15 mm）。

1.2.2 溫度、pH值及光照對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)影響

將培養(yǎng)7 d的3種炭疽病菌菌塊（d=5 mm）分別接至新的PDA培養(yǎng)基中，設(shè)計(jì)以下條件進(jìn)行培養(yǎng)：（1）放至10、15、20、25、28、30、35及40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每處理3個(gè)重復(fù)； （2）配制pH值分別為4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培養(yǎng)基，將3種炭疽病菌菌塊分別接至上述平板中，每處理3個(gè)重復(fù)； （3）將接種后的平板放置于完全光照、12 h光照/12 h黑暗、完全黑暗下進(jìn)行培養(yǎng)，每處理3個(gè)重復(fù)。5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.3 不同碳源、氮源對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)影響 以察式培養(yǎng)基為基礎(chǔ)[13]，分別以葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖、果糖作為培養(yǎng)基中的碳源，以牛肉膏、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、酵母浸粉作為培養(yǎng)基中的氮源，將3種炭疽病菌菌塊（d=5 mm）分別接至含有不同碳源、不同氮源的平板中，以不添加碳、氮源培養(yǎng)基為對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理3個(gè)重復(fù)，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.4 不同油茶炭疽病菌產(chǎn)孢能力、孢子萌發(fā)率及附著胞形成率比較 產(chǎn)孢能力：將培養(yǎng)7 d的3種炭疽病原菌塊（d=5 mm）分別接至100 mLPDA液體培養(yǎng)基中，160 r/min，28 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)，第5天用孢子過(guò)濾器收集孢子，并配制成懸浮液，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算分生孢子數(shù)；孢子萌發(fā)率及附著胞形成率：將濃度為1×105個(gè)/mL的孢子懸浮液加入凹玻片中，將凹玻片移入放有濕潤(rùn)脫脂棉的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理為5張玻片，每片檢查80個(gè)孢子，重復(fù)3次，12、24 h觀察并記錄分生孢子萌發(fā)率（以芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子長(zhǎng)度1/2為萌發(fā)），觀察并統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率及附著胞形成率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS、Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，用最小顯著差數(shù)法（LSD）比較相同條件下3種油茶炭疽病菌的差異顯著性（p=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同油茶炭疽病菌致病力比較

從海南省分離到的油茶炭疽病菌對(duì)油茶葉片的致病性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有供試菌株均能引起油茶葉片發(fā)?。▓D1），對(duì)照組中葉片刺傷處有很小的黑點(diǎn)，但并未擴(kuò)展。由表2可知，從4個(gè)油茶林中分離到的3種炭疽病菌的致病力存在較大差異，但屬于同種病菌的不同菌株間致病力差異不大，其中C. fructicola致病力最強(qiáng)，病情指數(shù)為76.33～78.33，明顯高于其他油茶炭疽病菌；而C. siamense致病力較強(qiáng)，病情指數(shù)為61.67～65.83。從澄邁林場(chǎng)分離的C. camelliae致病力低于C. fructicola及C. siamense，病情指數(shù)僅為57.5。從總體來(lái)看，3種病菌的致病力依次為C. fructicola>C. siamense>C. camelliae，與3種病菌的分離率相一致。

2.2 病原菌生物學(xué)特性

2.2.1 溫度、pH值及光照對(duì)不同炭疽菌生長(zhǎng)的影響 由圖2可知，3種油茶炭疽病菌在10～35 ℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)趨勢(shì)類似，最適生長(zhǎng)溫度均為28 ℃；在同一溫度下，C. siamense、C. fructicola與C. camelliae菌落生長(zhǎng)均存在顯著差異；28 ℃時(shí)，C. siamense生長(zhǎng)最快，其次是C. fructicola，C. camelliae生長(zhǎng)較慢。由圖3可知，3種病菌在pH4.0～11.0范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，當(dāng)pH6.0時(shí)，3種病菌均生長(zhǎng)最快，且菌落直徑有一定差異，C. fructicola為62.3 mm、C. siamense為64.7 mm、C. camelliae為57.4 mm。除pH5和pH6，C. fructicola與C. siamense菌落大小差異不顯著，但兩者與C. camelliae存在顯著差異。由表3可知，在相同光照處理下，C. fructicola、C. siamense與C. camelliae的菌落大小存在顯著差異；在12 h光照/12 h黑暗處理下，C. fructicola與C. siamense菌落直徑均達(dá)到最大值，但C. camelliae在連續(xù)光照條件下生長(zhǎng)最快，這可能與菌株本身特點(diǎn)有關(guān)。

2.2.2 不同碳源、氮源對(duì)炭疽病菌生長(zhǎng)的影響 由圖4可知，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae均可在不同碳源上生長(zhǎng)，除了以果糖為碳源外，3種病菌在相同碳源上生長(zhǎng)均存在顯著差異，其中C. fructicola和C. siamense在碳源為葡萄糖、麥芽糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好；C. camelliae在乳糖、葡萄糖中生長(zhǎng)最好，且3種病菌在淀粉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)差。當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae的菌落直徑分別為62.1、62.5和55.7 mm；當(dāng)碳源為麥芽糖時(shí)，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae的菌落直徑分別為60.5、61.0和55.0 mm。

由圖5可知，3種病菌對(duì)不同氮源的利用存在較大差異。C. fructicola在牛肉膏及酵母浸粉培養(yǎng)基上菌落直徑最大，C. siamense在硝酸鉀培養(yǎng)基中菌落直徑最大，C. camelliae在蛋白質(zhì)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好；3種病菌在氮源為氯化銨、硫酸銨的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)無(wú)顯著差異，均生長(zhǎng)最差，菌落直徑為20 mm左右，可見(jiàn)氯化銨、硫酸銨對(duì)炭疽病菌菌絲的生長(zhǎng)有抑制作用。

2.2.3 不同油茶炭疽病原產(chǎn)孢能力、孢子萌發(fā)率及附著胞形成率比較 3種油茶炭疽病原菌的產(chǎn)孢能力有差異，在培養(yǎng)5 d后，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae產(chǎn)孢量分別達(dá)到35.1×106、29.6×106和25.5×106個(gè)/mL。培養(yǎng)4 h后，C. fructicola和C. siamense的分生孢子開(kāi)始萌發(fā)，6 h后C. camelliae的分生孢子開(kāi)始萌發(fā)（圖6）。培養(yǎng)12和24 h后，3種病菌在分生孢子萌發(fā)率及附著胞形成率上均存在顯著差異，C. fructicola的分生孢子萌發(fā)率及附著胞形成率高于其他病菌（圖7），而C. camelliae分生孢子萌發(fā)率及附著胞形成率最低。

3 討論與結(jié)論

一種炭疽病菌可侵染多種寄主植物，同時(shí)多種炭疽病菌也可以侵染同一寄主植物。例如引起辣椒炭疽病的有C. acutatum、C. truncatum、C. fructicola和C. siamense等4種致病菌[14-16]。本實(shí)驗(yàn)室研究成員前期從海南省4個(gè)油茶林中分離鑒定了34株油茶炭疽病菌，共有3種不同炭疽病菌：C. fructicola、C. siamense及C. camelliae。本研究采用刺傷接種法對(duì)3種油茶炭疽病菌的致病力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)3種病菌存在明顯的致病力分化，并且致病力最強(qiáng)的C. fructicola在所有菌株中所占比例最大。王曉艷[17]從東北三省大豆主產(chǎn)區(qū)分離到8種鐮刀菌，通過(guò)致病力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在黑龍江、吉林和遼寧省F. oxysporum的致病力都是最強(qiáng)，病情指數(shù)明顯高于其他Fusarium spp.，同時(shí)F. oxysporum在分離到的8種鐮刀菌中出現(xiàn)頻率最高。本研究推測(cè)菌株致病力越強(qiáng)可能對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，因此在自然界中容易擴(kuò)展其分布范圍，這有待于進(jìn)一步研究。

3種油茶炭疽病菌生物學(xué)特性觀察結(jié)果表明，在相同溫度、pH、光照條件、碳源和氮源的條件下，3種油茶炭疽病菌的菌絲生長(zhǎng)存在一定差異。3種油茶炭疽病菌均可在10～35 ℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)，且最適生長(zhǎng)溫度均為28 ℃，這與朱英芝[9]的研究結(jié)果一致；3種病菌均可在pH4.0～11.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)，且在pH6.0時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，這與史紅安[18]報(bào)道的結(jié)果類似。強(qiáng)致病力C. fructicola的產(chǎn)孢能力、孢子萌發(fā)率及附著胞形成率均高于C. siamense和C. camelliae，推測(cè)不同油茶炭疽病菌的致病力可能與其產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及附著胞形成率存在一定關(guān)系。張新春等[19]對(duì)11株不同來(lái)源的荔枝膠孢炭疽菌進(jìn)行了致病性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同菌株的致病性存在差異，并發(fā)現(xiàn)強(qiáng)致病力菌株和弱致病力菌株在分生孢子及分生孢子盤(pán)形態(tài)方面存在一定差異，而在菌絲生長(zhǎng)、形態(tài)等方面類似；朱荷琴等[20]對(duì)棉花黃萎病不同致病菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)致病菌株的生長(zhǎng)量、產(chǎn)孢量及產(chǎn)毒量都高于弱致病菌株。

附著胞是病原菌在其芽管或老菌絲頂端發(fā)生膨大，分泌黏狀物，借以牢固地粘在宿主表面的一種侵染結(jié)構(gòu)，在其下形成纖細(xì)的針狀感染菌絲，以侵入宿主的角質(zhì)表皮而吸取養(yǎng)料[21]。因此，病菌附著胞形成的多少及快慢可能與其致病力有一定關(guān)系，致病力較強(qiáng)的菌株更易侵染油茶，使其在自然界生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)與繁殖中占有優(yōu)勢(shì)。但致病力差異不僅僅是菌株產(chǎn)孢量、分生孢子萌發(fā)率及附著胞形成率的差別，還與菌株其他遺傳特性有很大關(guān)系，筆者僅就3種油茶炭疽病菌的部分生物學(xué)特性進(jìn)行了探討，接下來(lái)可對(duì)不同油茶炭疽病菌的致病差異機(jī)制進(jìn)行研究，為針對(duì)性地防治油菜炭疽病提供理論依據(jù)。

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