劉先寶 李博勛 陳珊 黃貴修

摘 要 由多主棒孢引起的棒孢霉落葉病是橡膠樹的主要葉部病害，cassiicolin毒素是病菌的主要致病因子。本研究通過ITS序列分析對供試多主棒孢菌株進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定，利用cassiicolin毒素不同亞型編碼基因特異引物對不同地理來源和寄主來源的49個多主棒孢菌株毒素類型進(jìn)行了分析，并利用生物萎蔫法對不同亞型毒素進(jìn)行了致病性分析。結(jié)果顯示，78%供試菌株含有cassiicolin基因，其中Cas2亞型有10個菌株，Cas5亞型有28個菌株，其它為Cas0型（未檢測到cassiicolin毒素基因）。含有Cas5亞型的菌株均來源于橡膠樹，并且為橡膠樹上的優(yōu)勢群體；Cas2亞型菌株則來源于橡膠樹、黃瓜、番木瓜和木薯等不同作物；Cas2和Cas5毒素對不同橡膠樹品種的致病性存在明顯差異。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；多主棒孢；毒素；致病性

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Corynespora leaf fall （CLF） disease causing by Corynespora cassiicola is a very severe disease in rubber tree（Hevea brasiliensis）. A small secreted glycoprotein named cassiicolin was previously described as an important effect of C. cassiicola，which was able to induce disease symptoms on the host plant leaves. In this study，the diversity of the cassiicolin-encoding gene was analyzed using 49 C. cassiicola isolates sampled from various hosts and geographical origins in China. The cassiicolin gene was detected in 78% of the isolates， encoding up to 2 distinct protein isoforms（Cas2 and Cas5）. Twenty eight isolates carrying the Cas5 encoding gene（toxin class Cas5） were found in the dominant group in rubber tree in China，and only were found in the isolates from rubber tree. Ten isolates representative of the toxin class Cas2 were collected from rubber trees and other host plants including cucumber，papaya and cassava. The difference between Cas2 and Cas5 cassiicolin was very significant in pathogenicity profiles.

Key words Rubber tree；Corynespora cassiicola；Cassiicolin；Pathogenicity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.020

由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的橡膠樹棒孢霉落葉?。–orynespora leaf fall disease，CLFD）成為亞洲和非洲等天然橡膠產(chǎn)區(qū)最具破壞性的病害之一。該病在橡膠樹的各個生理期發(fā)生，在危害葉片上可表現(xiàn)出多種不同癥狀，引起橡膠樹反復(fù)落葉、樹冠稀疏，影響幼苗和幼樹生長，降低開割樹產(chǎn)膠量[1]。據(jù)報道，橡膠樹多主棒孢寄主選擇性毒素cassiicolin是該病原菌的主要致病因子。Breton等[2]首次從橡膠樹多主棒孢的培養(yǎng)濾液中分離純化到了寄主選擇性毒素，利用毒素抗體和純毒素證實了寄主選擇性毒素cassiicolin在多主棒孢致病過程中的作用。該毒素是一種通過毒素蛋白前體（pro-cassiicolin）剪接得到的小蛋白，與其它由核糖體合成的寄主選擇性毒素蛋白不具有同源性，是一種新型結(jié)構(gòu)毒素蛋白，具有與其它毒素蛋白不同的致病機制，病原菌與寄主間存在新的互作關(guān)系[3-5]。

近年來，研究人員在多主棒孢中先后發(fā)現(xiàn)了多個cassiicolin的亞型。劉曉妹[6]在中國橡膠樹多主棒孢中發(fā)現(xiàn)了Cas2亞型cassiicolin編碼基因。2012年，Déon等[7]從橡膠樹內(nèi)生多主棒孢菌株中發(fā)現(xiàn)了編碼Cas3和Cas4亞型的Cas3和Cas4基因。2014年，Déon等[8]對多主棒孢cassiicolin編碼基因多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了2個新亞型基因Cas5和Cas6，明確了多主棒孢存在6個毒素亞型。具有Cas1亞型的菌株致病性最強，主要分布在菲律賓和喀麥隆、加納等非洲國家；Cas2 和Cas6亞型菌株來源于國外非橡膠樹作物；Cas3和 Cas4亞型均來自巴西橡膠樹內(nèi)生多主棒孢菌株；Cas5亞型菌株則來源于馬來西亞、斯里蘭卡等亞洲國家的橡膠樹。還有一些橡膠樹多主棒孢菌株中未檢測到cassiicolin基因，劃分為Cas0型，主要分布于馬來西亞、斯里蘭卡、印度和泰國等亞洲各植膠國家[8-9]。本研究利用cassiicolin毒素不同亞型的特異引物對中國橡膠樹多主棒孢毒素的類型及其分布特征進(jìn)行分析，并對不同亞型毒素的致病性進(jìn)行了初步分析，這對深入了解多主棒孢的生物學(xué)功能和遺傳進(jìn)化關(guān)系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

49個供試菌株寄主來源包括橡膠樹（Hevea brasiliensis）、番木瓜（Carica papaya）、木薯（Manihot utilissima）、黃瓜（Cucumis sativus）和豇豆（Vigna unguiculata）等作物，其中橡膠樹38株，番木瓜5株，木薯3株，黃瓜2株，豇豆1株；地理來源包括海南、廣東、廣西、云南（表1）。除2個分離自黃瓜的菌株由中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所提供，其余菌株由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所橡膠樹病害課題組分離保存。為了確保遺傳一致性，對各菌株進(jìn)行了單孢純化。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增和測序 菌體收集和DNA提取參照劉先寶等[10]的研究方法。本研究PCR擴(kuò)增所用的引物參見表2，反應(yīng)條件參照White等[11]和Déon等的方法[8]。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得產(chǎn)物經(jīng)Omega公司回收試劑盒回收后，克隆到pGM18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將陽性克隆送交華大基因技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。將序列在GeneBank中進(jìn)行BLAST分析，并用MEGA6.0軟件對其進(jìn)行序列比對，分析序列的變異情況；利用MJ（Maximum Likelihood）統(tǒng)計方法中的Tamura-Nei model構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 致病性分析 選擇具有不同類型毒素基因的多主棒孢菌株進(jìn)行致病性測定。測定方法采用李博勛等[12]的毒素生物萎蔫法，計算各種質(zhì)粗毒素經(jīng)處理后的萎蔫指數(shù)，分析不同類型毒素的致病性差異。致病性分析所獲數(shù)據(jù)均采用SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，按照李博勛等[12]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列分析

利用引物ITS1/ITS4從所有供試分離物的基因組DNA中均可擴(kuò)增到一條大小為559 bp的單一條帶，將片段回收測序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast比對，確定所有分離物均為多主棒孢。序列之間比對發(fā)現(xiàn)，除在ITS1區(qū)的第135位點存在單核苷酸多態(tài)性，其他序列完全一致（表1）。

2.2 毒素基因檢測與序列分析

分子檢測結(jié)果見表1。49個供試菌株中78%的菌株被檢測到含有cassiicolin基因，其中Cas2亞型有10個菌株，Cas5亞型有28個菌株，其它菌株中未檢測到cassiicolin毒素基因，暫定為Cas0型。Cas5亞型菌株均來源于橡膠樹，并且為橡膠樹上的優(yōu)勢群體；Cas2亞型菌株則只有5株來源于橡膠樹，其余來源于黃瓜、番木瓜和木薯等不同作物。在不同亞型橡膠樹多主棒孢菌株的地理分布方面，Cas2亞型菌株在海南、廣東和云南均有分布，但幾率非常??；而Cas5亞型菌株在所有植膠區(qū)均有分布，不同毒素亞型菌株的分布與地理來源沒有明顯相關(guān)性。

經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，本研究中測定的Cas2（KU561095）和Cas5（KU561094）毒素基因序列與GeneBank中已公布的相應(yīng)序列相似性非常高，均超過99%（圖1）。在所有供試菌株中均未檢測到含有Cas1、Cas3、Cas4 和Cas6基因的菌株。通過多主棒孢cassiicolin基因系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)Cas1、Cas2和Cas6親緣關(guān)系更近，聚在一個大分支上，而Cas3、Cas4和Cas5則聚在另一個大分支上。

2.3 致病性分析

致病性結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cas2、Cas5和Cas0 3種粗毒素對幾種橡膠品種致病性存在顯著差異。Cas2型粗毒素對IAN873的致病性最強，Cas5型粗毒素對GT1的致病性最強，Cas0致病性整體較弱，見圖2。

3 討論與結(jié)論

真菌ITS序列分析已經(jīng)被應(yīng)用于很多屬的系統(tǒng)發(fā)育研究。在種內(nèi)，ITS序列對于揭示異域分布或間斷分布種群的關(guān)系具有一定的潛力。Nghia等[13]和Nguyen等[14]研究發(fā)現(xiàn)在橡膠樹多主棒孢ITS的第135位點處存在單核苷酸多態(tài)性（C/T），根據(jù)這個差異將多主棒孢分離物劃分為2個小種。在ITS1的第135位點具有C堿基的分離物被劃分為Race1，而具有T堿基的分離物屬于Race2。Race1分離物主要侵染RRIM600和其它一些早期品系，Race2分離物則主要侵染RRIM 2020和一些更新的品系。本研究通過對中國多主棒孢ITS序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在ITS1區(qū)的第135位點處也存在單核苷酸多態(tài)性（C/T），而該位點的單核苷酸多態(tài)性與菌株的毒素類型存在一定相關(guān)性，其中Cas2亞型菌株在該處均為T堿基，而Cas5亞型菌株此處均為C堿基，這些可能與多主棒孢的小種分化有關(guān)。要明確本研究中供試分離物的小種劃分，還需要使用以上提到的品系進(jìn)行致病性分析。

cassiicolin基因?qū). cassiicola整體的遺傳結(jié)構(gòu)具有重要的貢獻(xiàn)，這些基因可能在該菌的生物學(xué)功能和遺傳進(jìn)化中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，中國橡膠樹多主棒孢菌株具有Cas2和Cas5 2種亞型，其中Cas5亞型為橡膠樹上多主棒孢的優(yōu)勢群體，還有一些菌株為Cas0型，而番木瓜、木薯、黃瓜等其它作物上的多主棒孢菌株主要為Cas2亞型和Cas0型。值得注意的是，在國外尚未發(fā)現(xiàn)有橡膠樹多主棒孢Cas2亞型菌株。Déon等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Cas2亞型是僅存在非橡膠樹作物上的多主棒孢菌株，Cas5亞型是僅存在于亞洲國家的橡膠樹多主棒孢菌株。Shuib等[9]對馬來西亞橡膠樹多主棒孢的Cassiicolin基因進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，其主要為Cas5亞型和Cas0型。筆者在多次的橡膠樹棒孢霉落葉病病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，若橡膠苗圃地周圍由多主棒孢引起的番木瓜葉斑病發(fā)病嚴(yán)重，則該苗圃棒孢霉落葉病發(fā)病也非常嚴(yán)重。由此推測，中國的Cas2亞型橡膠樹多主棒孢可能來源于其它作物，但還需做進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育分析驗證試驗。

通過致病性研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的毒素對不同橡膠品系的致病性存在明顯差異，尤其是GT1和IAN873 2個品系。Cas2亞型毒素對IAN873的致病性強，對GT1致病性弱；而Cas5亞型毒素對這2個品系的致病性情況恰好相反。Breton等[2]利用來源于菲律賓、喀麥隆、印度和斯里蘭卡等國家的供試菌株進(jìn)行致病性分析發(fā)現(xiàn)，所有供試菌株對GT1品系的致病性較弱，而對IAN873品系的致病性則較強，根據(jù)文獻(xiàn)報道，這些國家橡膠樹多主棒孢主要為Cas1亞型或Cas0型[8]，這與本研究Cas2亞型毒素的致病性相似。由于菌株毒素類型的不同，造成致病性和寄主范圍有所差異。為了明確中國橡膠樹多主棒孢不同類型毒素的寄主專化性和小種的劃分，還需要選擇更多的橡膠品系和寄主植物做進(jìn)一步的致病性研究。

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