楊麗娜　段國(guó)華　覃雁瑜　祝雯　潘哲超　隋啟君　詹家綏

摘 要 利用11個(gè)含有不同單顯性（R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11）抗馬鈴薯晚疫病的鑒別寄主，對(duì)云南省會(huì)澤縣村同一發(fā)病田塊前、中、后期3個(gè)群體的馬鈴薯晚疫病菌59、158和75個(gè)菌株進(jìn)行毒性頻率和小種鑒定，分別鑒定出31、60和30個(gè)小種，大部分小種只檢測(cè)到一次，其中優(yōu)勢(shì)小種為超級(jí)小種（含有11個(gè)毒性基因的晚疫病菌），占整個(gè)群體的53.33%；隨著發(fā)病時(shí)間的推移，優(yōu)勢(shì)小種頻率、小種復(fù)雜度呈上升趨勢(shì)，但小種多樣性呈降低趨勢(shì)，在馬鈴薯生育期間除了avr4外，其它毒性基因的頻率未發(fā)生顯著變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明云南省馬鈴薯晚疫病菌小種演化速度快，小種結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在該地區(qū)種植起源于Solanum demission的R1～R11抗性基因存在較高的失效風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯晚疫病菌；毒性基因；小種；進(jìn)化；鑒別品種；病害防治

中圖分類(lèi)號(hào) S435.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Race and virulence factor of 59， 158 and 75 Phytophthora infestans isolates sampled from early， middle and late stages of late blight epidemics respectively in a potato field located in Huize，Yunnan in 2012 evaluated on 11 potato differentials each carrying one of R1-R11 resistance genes. A total of 31， 60 and 31 races were found in the early-， middle-and late-epidemic season， respectively. Super-race able to induce the late blight disease on all 11 differentials dominated in all three collections， accounting for 53.33% of combined population， while most of other races were detected only once. Over the potato growing season， the frequency of the super-race and race complexity gradually increased while the race diversity decreased directionaly. Except avr4， no significant change in the frequency of virulence factors was detected over the single growing season. These results suggest a quick evolution of race structure and an increasing risk of major resistance breakdown in Yunnan.

Key words Phytophthora infestans；Virulence factor；Race complexity；Evolution；Differential cultivar；Disease management

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.026

隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，馬鈴薯已經(jīng)成為僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物[1]，因此其病害防治工作也越來(lái)越受到人們的重視。由致病疫霉Phytophthora infestans（Mont.）de Bary引起的晚疫病是馬鈴薯的最主要病害，據(jù)文獻(xiàn)記載該病害曾導(dǎo)致愛(ài)爾蘭大饑荒，造成數(shù)百萬(wàn)人口死亡和流離失所，影響著世界人口分布[2]。目前，晚疫病仍然是馬鈴薯的毀滅性病害[3]，每年全球由該病害引起的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)上百億美元[4-5]。

噴施化學(xué)農(nóng)藥和種植抗性品種是防治馬鈴薯晚疫病的主要措施。噴施化學(xué)農(nóng)藥雖然可以在短期內(nèi)獲得良好的防治效果，但存在使用成本高、污染環(huán)境及農(nóng)藥殘留等問(wèn)題。與之相比，使用抗性品種可以避免以上問(wèn)題，是防治馬鈴薯晚疫病的經(jīng)濟(jì)環(huán)保措施。到目前為止，已經(jīng)有11個(gè)起源于馬鈴薯野生親緣種地霉松（Solanum Demmissum）的抗晚疫病主效抗性基因被克隆和利用[6]。當(dāng)具有主效抗性基因的馬鈴薯品種被種植時(shí)，對(duì)晚疫病的防治效果非常明顯，但是這種垂直抗性往往會(huì)在種植幾年后消失。這和現(xiàn)在農(nóng)業(yè)一年多茬及單一品種大規(guī)模的密集種植模式有關(guān)[7]，此類(lèi)種植模式人為加大了對(duì)病原菌的選擇壓力，使病原菌的進(jìn)化速度加快，能使晚疫病菌在短期內(nèi)形成新的毒性基因或小種克服寄主的抗性。所以馬鈴薯晚疫病菌小種的演化及時(shí)空間分布直接決定了馬鈴薯抗性品種的有效性及其使用壽命。

中國(guó)馬鈴薯晚疫病菌小種的分布在不同地區(qū)及同一地區(qū)不同時(shí)間都存在著一定的差異[8-17]。這些差異一方面是由中國(guó)幅員遼闊、從南到北跨越不同氣候帶、各地海拔高低不等且地勢(shì)復(fù)雜的自然因素導(dǎo)致的[18-20]；另一方面是由品種的選用[21-25]、殺菌劑的使用[26]、及不同的種植模式導(dǎo)致；除此之外還和晚疫病菌本身變異及繁殖速度較快有關(guān)系[27-29]。這導(dǎo)致了中國(guó)馬鈴薯晚疫病菌小種的種類(lèi)越來(lái)越多、復(fù)雜度也越來(lái)越高[30-32]。同時(shí)能侵染起源于馬鈴薯野生親緣種地霉松的全部11個(gè)主效抗性基因的超級(jí)小種近年在全國(guó)各地不斷被檢測(cè)出來(lái)，并且在晚疫病菌群體中所占的比例越來(lái)越大[33-35]。在云南省，趙志堅(jiān)等[36]于2003年檢測(cè)到1株超級(jí)小種，但到了2005年，超級(jí)小種在晚疫病菌群體中的比例已達(dá)到21.05%[37]。超級(jí)小種出現(xiàn)最直接的危害是使現(xiàn)有的具有馬鈴薯野生親緣種地霉松血緣的垂直抗性失去使用價(jià)值，意味著無(wú)論使用的品種是單抗還是多個(gè)抗性組合都對(duì)晚疫病菌幾乎沒(méi)有抵抗能力，所以必須重視新抗源的篩選、鑒定和利用。超級(jí)小種在群體中所占比例越來(lái)越高的發(fā)展趨勢(shì)已對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)構(gòu)成了極大的威脅，因此對(duì)病原群體小種結(jié)構(gòu)的繼續(xù)監(jiān)測(cè)具有極大的應(yīng)用價(jià)值。本研究于2012年對(duì)來(lái)自同一田塊同一季節(jié)不同馬鈴薯生長(zhǎng)期晚疫病菌小種的鑒定和比較，了解晚疫病菌小種和毒性基因在短時(shí)間內(nèi)的變化，為馬鈴薯抗性品種的選用、部署及晚疫病菌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及植株 試驗(yàn)所用的馬鈴薯晚疫病菌均采集于云南省會(huì)澤縣同一塊馬鈴薯試驗(yàn)田，共293株，其中59株采自2012年7月11日（前期），158株采自2012年7月31日（中期）， 75株采自2012年8月14日（后期）。鑒別寄主由11個(gè)含有單個(gè)主效抗性基因（R1～R11） 的抗病品種和1個(gè)不含抗病基因的感病材料（r）組成，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所陳慶河研究員提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 晚疫病菌用黑麥培養(yǎng)基培養(yǎng)。晚疫病菌分離純化及小種鑒定過(guò)程中所用的培養(yǎng)基為水瓊脂。鑒別寄主培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 樣本的采集及純化 采集具有單個(gè)典型病斑的馬鈴薯葉片（發(fā)病前期田間只有少量病斑，田間平均發(fā)病率<1.0%；發(fā)病中期田間病斑數(shù)目較多，平均發(fā)病率25%～40%；發(fā)病后期病斑數(shù)量非常多，平均發(fā)病率約>75%）。采集的2病葉之間的間隔至少是2 m。為了防止采集過(guò)程中樣本的交叉感染，每片病葉都用衛(wèi)生紙包好并放在獨(dú)立的牛皮紙信封（或硫酸紙袋）中。樣本采集后立即放入已放有冰袋的保溫箱中低溫存放，并在24 h之內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離純化。

分離純化前先用清水對(duì)葉片進(jìn)行清洗，去除葉片表面所帶有的雜菌。清洗后的葉片稍微晾干，葉片背面朝上放在2%的水瓊脂上進(jìn)行保濕培養(yǎng)，待20～30 h后病斑形成氣生菌絲，用滅菌過(guò)的解剖針挑取單根菌絲，置添加有氨芐（100 mg/L）和利福平（10 mg/L）的黑麥選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。待晚疫病菌絲從選擇性培養(yǎng)基上長(zhǎng)出后，再進(jìn)行一次單菌絲挑取和選擇性培養(yǎng)以確保分離的純度。晚疫病菌分離純化的步驟參見(jiàn)祝雯等[38]的研究方法。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 黑麥培養(yǎng)基制作方法為：50 g黑麥浸泡2～3 h后用大功率料理機(jī)磨成勻漿，65 ℃水浴2 h后用雙層紗布過(guò)濾，取上清液用純凈水定容至1 L，加瓊脂粉12 g攪拌均勻后分裝，用121 ℃高壓滅菌20 min。分離純化后的晚疫病菌接種在黑麥培養(yǎng)基上于18 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，14 d后用于小種的鑒定。

水瓊脂的制作方法為：10 g瓊脂粉加到1 L無(wú)菌水中煮沸，待冷卻到40 ℃，在培養(yǎng)皿中倒入薄薄一層即可使用。

MS培養(yǎng)基制作方法為：4.74 g MS，30 g蔗糖，5 g瓊脂粉加無(wú)菌水定容至1 L后分裝到組培瓶或三角瓶中，用121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 鑒別寄主的培養(yǎng) 選取長(zhǎng)勢(shì)較好且無(wú)污染的鑒別寄主組培苗進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁，于20 ℃條件下培養(yǎng)并用白熾燈管進(jìn)行每天18 h的輔助光照。待組培苗長(zhǎng)到株高15～20 cm、葉片直徑1.5 cm時(shí)進(jìn)行小種測(cè)定。

1.2.4 毒性基因和小種的鑒定 晚疫病菌的毒性組成和小種采用葉蝶法[39]：即取18 ℃培養(yǎng)14 d的晚疫病菌平板，加5 mL無(wú)菌水用無(wú)菌玻璃棒輕輕刮培養(yǎng)基表面洗脫晚疫病菌孢子囊，所得懸浮液在2 750 r/min 15 min離心后棄上清液，重新加入無(wú)菌水將孢子囊濃度調(diào)至5x10-4 mL并放于4 ℃冰箱中備用。

在無(wú)菌環(huán)境下，將新摘取的鑒別寄主葉片背面朝上放在1%的水瓊脂上，用移液槍吸取10 μL孢子囊懸浮液，輕輕滴在葉片上，放置于18 ℃、16 h/d輔助光照培養(yǎng)7 d后觀測(cè)并記錄結(jié)果。重復(fù)3次，空白為對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

如果晚疫病菌株能在特定的鑒別寄主離體葉片上形成病斑，并在顯微鏡下觀測(cè)到晚疫病菌孢子囊，則該菌株攜帶和鑒別寄主對(duì)應(yīng)的毒性基因。菌株小種類(lèi)型由其所含的毒性基因界定。小種復(fù)雜度是指每個(gè)晚疫病菌攜帶毒性基因的個(gè)數(shù)，當(dāng)小種復(fù)雜度為11時(shí)該菌株可以同時(shí)侵染11個(gè)抗性寄主，反之小種復(fù)雜度為0的菌株只能使感病寄主發(fā)病。小種多樣性[40]由POPGENE[41]計(jì)算得出，發(fā)病前、中、后期毒性基因頻率的差異用列表卡方檢測(cè)[42]。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，所有的毒性基因都能在晚疫病菌中檢測(cè)到；在發(fā)病前、中、后期80%之上的晚疫病菌都能使帶有R3、R4、R6、R7、R8和R10抗性基因的鑒別寄主發(fā)病；晚疫病菌對(duì)R5和R11的較為敏感，平均分別只有68%和67%的菌株能侵染這2個(gè)鑒別寄主；除了avr7和avr11，大部分毒性基因的頻率隨著流行季節(jié)而提高，但卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，除avr4之外其余的10個(gè)毒性基因在流行季節(jié)的頻率沒(méi)有發(fā)生顯著變化（表1）。

由表2可知，在晚疫病發(fā)病的前、中、后期3個(gè)群體中，遺傳多樣性最低的是發(fā)病后期的avr4，最高的是前期的avr5；從群體角度出發(fā)，前、中、后期11個(gè)毒性基因的平均遺傳多樣性分別為0.30、0.30和0.23，呈降低趨勢(shì)。

由表3可知，發(fā)病中期的小種個(gè)數(shù)多達(dá)60個(gè)，發(fā)病前期和后期小種個(gè)數(shù)幾乎一樣，分別為31和30個(gè)；其中每一生育期優(yōu)勢(shì)小種均為超級(jí)小種，即同時(shí)攜帶11個(gè)毒性基因，能同時(shí)侵染所有的鑒別寄主，且其在群體中的比例隨流行時(shí)間呈上升趨勢(shì)，分別占前、中、后期群體個(gè)數(shù)的42.37%、46.20%和53.33%。除超級(jí)小種之外其他小種出現(xiàn)的頻率較低，為1.33%～5.33%（圖1，表3）。小種的種類(lèi)在不同時(shí)期的變化很大，只有6個(gè)小種同時(shí)出現(xiàn)在晚疫病發(fā)病的前、中、后期，其余小種大部分只在1個(gè)發(fā)病時(shí)期出現(xiàn)1次（圖1）

發(fā)病前期香農(nóng)指數(shù)為0.64，隨著發(fā)病時(shí)間的推移，小種遺傳多樣性逐漸降低，后期為0.54，但小種復(fù)雜度呈上升趨勢(shì)，發(fā)病前、中、后期分別是8.87、8.90和9.37（表3）。說(shuō)明本試驗(yàn)檢測(cè)的晚疫病菌小種復(fù)雜度很高，只在發(fā)病中期和后期各檢測(cè)到1株不攜帶毒性基因馬鈴薯晚疫病菌，90%以上的小種都含有3個(gè)以上的毒性基因。

3 討論與結(jié)論

中國(guó)是馬鈴薯的種植大國(guó)[43-44]，面積和產(chǎn)量分別占世界的26.3%和22.2%[45]。同時(shí)云南省又是中國(guó)馬鈴薯的種植大省，所以云南省晚疫病菌小種的研究對(duì)馬鈴薯抗性品種的使用和晚疫病的防治都有重要的意義。與之前云南晚疫病菌小種的研究相比[9]，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2012年云南會(huì)澤縣晚疫病菌超級(jí)小種的數(shù)量明顯上升并成為優(yōu)勢(shì)小種，在整個(gè)發(fā)病過(guò)程中40%～53%的馬鈴薯晚疫病菌能攻克現(xiàn)有的起源于馬鈴薯親緣種地霉松的所有11個(gè)垂直抗性基因。這一結(jié)果與前人的研究相似[34]，表明在生產(chǎn)中具有地霉松血緣的單抗性及多抗性馬鈴薯品種可能已經(jīng)失去了對(duì)晚疫病的防治作用。

小種多樣性和復(fù)雜度是研究小種結(jié)構(gòu)，病原演化趨勢(shì)和抗性基因利用潛力的重要參數(shù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從發(fā)病前期到后期小種多樣性逐漸降低，說(shuō)明晚疫病菌群體受到寄主的定向選擇[46]，在該選擇壓力下某些適應(yīng)性較低的小種類(lèi)型被逐漸淘汰，而另外一些小種類(lèi)型（如超級(jí)小種）則由于適應(yīng)性較高頻率逐漸升高。從小種復(fù)雜度結(jié)果可以看出，2012年云南省會(huì)澤縣的晚疫病菌平均每個(gè)都含有8個(gè)毒性基因，并且隨著發(fā)病時(shí)間的推移小種復(fù)雜度可達(dá)到9.37，這可能是由超級(jí)小種在群體中的比例逐漸提高造成的，這個(gè)結(jié)果同樣也證明復(fù)雜小種的晚疫病菌具有較高的生存優(yōu)勢(shì)，更容易通過(guò)外界選擇保留下來(lái)。

發(fā)病前、中、后期大部分毒性基因頻率都逐漸提高，說(shuō)明晚疫病群體受到寄主的定向選擇。除avr4外，卡方檢驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他毒性基因在流行期間發(fā)生顯著性的頻率變化，其原因可能是在發(fā)病前期這些基因的頻率已經(jīng)很高（63%～92%），樣本采集過(guò)程中發(fā)病前、中、后期之間的采樣間隔較短，約21 d，定向選擇的作用很難有效地體現(xiàn)出來(lái)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2012年云南省會(huì)澤縣的晚疫病菌小種復(fù)雜度較高，超級(jí)小種為優(yōu)勢(shì)種，種植具有地霉松血緣的單抗病或多抗品種對(duì)晚疫病菌的防治都不會(huì)起太大作用，這給馬鈴薯抗性品種的選育和使用帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。因此，急切需要發(fā)掘新的抗性基因，培育帶地霉松以外新血緣的抗性品種；重視馬鈴薯抗性基因的合理布局及水平抗性[47-48]的利用，把進(jìn)化理論[7， 49]和先進(jìn)的育種技術(shù)[50-51]（如分子輔助育種）應(yīng)用到品種選育中去，以加快抗性新品種的選育及延長(zhǎng)抗性品種的使用壽命；加強(qiáng)對(duì)晚疫病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，降低晚疫病藥劑防治的生態(tài)和環(huán)境成本，為晚疫病的可持續(xù)性防治奠定基礎(chǔ)。

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