卜淑敏 楊涵

摘要：采用去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型，觀察跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)、全身垂直振動(dòng)、金雀異黃酮、雌激素和氯化鋰5種干預(yù)療法對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)目和過氧化物酶體增殖激活物受體γ2（PPARγ2）蛋白表達(dá)水平的影響。方法：將80只3月齡雌性SD大鼠按體重分層后隨機(jī)分為假手術(shù)組和去卵巢組，去卵巢10周后，將去卵巢組大鼠按體重分層后又隨機(jī)分為去卵巢組、雌激素組、金雀異黃酮組、氯化鋰組、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組和全身垂直振動(dòng)組。去卵巢第11周時(shí)，不同組別的大鼠開始進(jìn)行不同干預(yù)處理。干預(yù)8周后，用HE染色法觀察左脛骨組織形態(tài)學(xué)和骨髓脂肪細(xì)胞空泡數(shù)目的變化；用Western blotting檢測(cè)右脛骨近端骨組織PPARγ2蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果：經(jīng)雌激素、金雀異黃酮、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和氯化鋰干預(yù)后，去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨松質(zhì)骨骨小梁數(shù)目顯著增加，脂肪空泡數(shù)目和PPARγ2蛋白表達(dá)水平顯著下降，而經(jīng)全身垂直振動(dòng)干預(yù)后，去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨松質(zhì)骨骨小梁數(shù)目顯著增加，脂肪空泡數(shù)量顯著減少，但PPARγ2蛋白表達(dá)水平無顯著變化。結(jié)論：雌激素、金雀異黃酮、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和氯化鋰可能是通過下調(diào)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織PPARγ2蛋白的表達(dá)水平而抑制去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨髓細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。

關(guān)鍵詞： 去卵巢大鼠；跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)；全身垂直振動(dòng)；金雀異黃酮；PPARγ2

中圖分類號(hào)： G 804.2 文章編號(hào)：1009783X（2016）03027004 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Abstract：The aim of this study was to investigate the effects of five different intervention methods on the bone histology and the protein expression of peroxisomeproliferatoractivated receptorgamma2 （PPARγ2） in the ovariectomized osteoporosis rats.Methods：Eighty healthy female SD rats，aged 3 months，were randomly divided into the following two groups by body weight：shamoperation （Sham） and ovariectomized （OVX）.After ten weeks，the OVX group rats were randomly divided into the following six groups by body weight：OVX；17βestradiol （E2）；Genisteine （G）；treadmill exercise （TE）；Lithium chloride （LiCL）；Wholebody vertical vibration （WBVV）.Then the rats began to be treated with different intervention methods.At the end of 8 weeks intervention，during 3648 hours，the tibia was isolated.The morphological changes of the left tibia were observed by HE staining and the protein expression of PPARγ2 in right tibia were detected by western blot.Results：After treated with E2，treadmill exercise，wholebody vertical vibration，genistein and LiCL，the number of trabecular bone were significantly increased and the number of bone marrow adipocytes were significantly decreased than that of in OVX group.After treated with E2，treadmill exercise，genistein and LiCL，the protein expression of PPARγ2 were significantly lower than that of in OVX group.However，wholebody vertical vibration treatment had no significant difference.Conclusions：Treadmill exercise，E2，genistein and LiCL could inhibit the differentiation of bone marrow stromal cells to fat cells by inhibiting the protein expression of PPARγ2 in bones of OVX osteoporosis rats.

Keywords：ovariectomized osteoporosis rats；treadmill exercise；genistein；lithium chloride；PPARγ2

在人的一生中，骨骼都在持續(xù)經(jīng)歷著骨形成和骨吸收的重塑過程。在生長(zhǎng)發(fā)育期和年輕時(shí)，骨平衡是正平衡，即骨形成大于骨吸收；但40歲以后，骨吸收則大于骨形成，骨量開始下降，隨著年齡進(jìn)一步增加會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀[1]。絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素的缺乏是引起骨量急劇下降、發(fā)生骨質(zhì)疏松的主要原因[2]。雖然目前治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的方法有激素替代療法、雙磷酸鹽、植物雌激素等藥物療法，以及運(yùn)動(dòng)、電脈沖刺激等非藥物療法[37]，但絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的防治仍具有挑戰(zhàn)性。盡管人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證明了跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)、金雀異黃酮、全身垂直振動(dòng)、雌激素和氯化鋰等不同療法的骨質(zhì)疏松治療效應(yīng)，但對(duì)其作用機(jī)制還不是很清楚。

隨著年齡的增加，成骨發(fā)生的下降會(huì)伴隨骨髓脂肪發(fā)生的增加，因?yàn)槌晒羌?xì)胞和脂肪細(xì)胞來源于共同的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞[8]。已有研究表明， 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生與骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞方向分化的增加有關(guān)[9]，因此，調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的平衡可能是骨質(zhì)疏松防治的新策略。動(dòng)物研究[10]表明，過氧化物酶體增殖激活物受體γ2（PPARγ2）能使骨髓細(xì)胞脂肪分化增加，導(dǎo)致骨丟失。鑒此，本文采用去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型，觀察雌激素、全身垂直振動(dòng)、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)、金雀異黃酮和氯化鋰5種干預(yù)療法對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)目和PPARγ2蛋白表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠購(gòu)自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部（動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）20110012）。17βestradiol （E2）和金雀異黃酮購(gòu)自Sigma公司。PPARγ2和βactin抗體購(gòu)自SC公司。BCIP/NBT顯色濃縮液和馬抗小鼠IgG/堿磷酶標(biāo)記抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SDSPAGE蛋白上樣緩沖液和RIPA蛋白裂解液（強(qiáng)型）購(gòu)自海門碧云天生物技術(shù)有限公司。Leica軟組織切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)。研究級(jí)正置熒光顯微鏡購(gòu)自日本尼康。DSPT202型大鼠跑臺(tái)由杭州段氏制造廠生產(chǎn)。DYY7C型電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠。垂直振動(dòng)臺(tái)由北京雅士林廠生產(chǎn)。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

大鼠每天自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料，自由飲用自來水，每籠5只分籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱量各只大鼠的體重，然后按體重分層后隨機(jī)分為去卵巢手術(shù)組（68只）和假手術(shù)組（12只）。2組大鼠手術(shù)前均禁食12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，從背部切除手術(shù)組大鼠雙側(cè)卵巢，而假手術(shù)組大鼠的卵巢不切除，只切除卵巢脂肪墊中與卵巢相當(dāng)大的一塊脂肪。無菌手術(shù)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部進(jìn)行[SYXK（京）20110039]。術(shù)后靜養(yǎng)10周，第11周時(shí)稱量去卵巢組大鼠體重并按體重分層后將其隨機(jī)分為去卵巢組（11只）、金雀異黃酮組（10只）、雌激素組（9只）、跑臺(tái)組（9只）、振動(dòng)組（9只）、氯化鋰組（9只）。實(shí)驗(yàn)過程中有11只大鼠先后死亡。

1.2.2 不同干預(yù)療法處理方案

手術(shù)后第11周，不同組別的去卵巢大鼠分別進(jìn)行不同的干預(yù)處理，具體干預(yù)方案同前期報(bào)道[11]， 即雌激素組采用頸部皮下注射17β雌二醇，劑量為25 μg/kg體重，每周3次；金雀異黃酮組采用灌胃，劑量為1 mg/kg體重，每周7次；氯化鋰組采用腹腔注射氯化鋰，劑量為15 mg/kg體重，每周3次。跑臺(tái)組每次進(jìn)行速度18 m/min、坡度5°、時(shí)間40 min的跑臺(tái)訓(xùn)練，每周4次；振動(dòng)組每天進(jìn)行2次時(shí)間15 min、頻率90 Hz、振幅0.5 mm的振動(dòng)訓(xùn)練，每周7次。

1.2.3 HE

將固定好的脛骨近端投入15%EDTA溶液中脫鈣，脫鈣后用常規(guī)石蠟包埋方法進(jìn)行處理，用Leica軟組織切片機(jī)將骨標(biāo)本切成5 μm切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、常規(guī)蘇木素伊紅染色、中性樹脂封片后，在顯微鏡下觀察拍照計(jì)數(shù)脂肪空泡數(shù)目。

1.2.4 Western blot

Western blot方法參照前期報(bào)道[11]。將稱量的200 mg骨組織放入研磨器中，加入液氮迅速研磨成粉末后移入1.5 mL離心管，加入1 mL組織裂解液，放入低溫離心機(jī)中作用1 h后，12 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清，留一部分檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，其余蛋白樣品與SDSPAGE蛋白上樣緩沖液（5X）按照4∶1的比例混勻，沸水變性5 min，分裝后凍入-80 ℃冰箱。取10～15 μL蛋白樣品上樣，80 V電壓電泳約2 h后，再以80 V電壓轉(zhuǎn)移2 h。取出PVDF膜，放入5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜，次日用TBST緩沖液洗4次，每次10 min，分別加馬抗小鼠Ig/G堿磷酶標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，用TBST緩沖液洗4次，每次10 min，然后將PVDF膜放入BCIP/NBT顯色液中避光顯色至條帶出現(xiàn)，將膜撈出放入水中以終止顯色，用數(shù)碼相機(jī)拍照，用Quantity One軟件掃描計(jì)算各條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用單因素方差進(jìn)行分析。若方差齊時(shí)，用LSD posthoc檢驗(yàn)；若方差不齊時(shí)，用Tamhane posthoc檢驗(yàn)。P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 5種干預(yù)療法對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠體重、腹部脂肪重量和子宮重量的影響

干預(yù)8周后，與假手術(shù)組大鼠比較，去卵巢組大鼠體重和腹腔脂肪重量顯著增加，而子宮重量顯著降低，見表1。與去卵巢組大鼠比較，雌激素組、金雀異黃酮組、跑臺(tái)組和振動(dòng)組大鼠體重和腹腔脂肪重量均顯著下降，而氯化鋰組大鼠未見顯著性差異。與去卵巢組大鼠比較，只有雌激素組大鼠子宮重量顯著增加，其余各組未見顯著性差異。與干預(yù)前體重比較，去卵巢組顯著增加，雌激素組顯著下降，而其余4組未見顯著性差異。與去卵巢組比較，雌激素組、金雀異黃酮組、跑臺(tái)組和振動(dòng)組干預(yù)前后體重的變化量均顯著降低，而氯化鋰組未見顯著性差異。

2.2 5種干預(yù)療法對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨近端骨組織形態(tài)學(xué)和脂肪空泡數(shù)目的影響

如圖1和圖2所示，假手術(shù)組大鼠脛骨近端骨小梁致密，排列整齊，大鼠去卵巢后骨小梁明顯變得稀疏，出現(xiàn)斷裂、消失，骨髓腔內(nèi)脂肪空泡數(shù)目顯著增加，經(jīng)雌激素、金雀異黃酮、氯化鋰、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和全身垂直振動(dòng)干預(yù)8周后，骨小梁增加，骨髓腔內(nèi)脂肪空泡數(shù)目顯著減少。

2.3 不同干預(yù)療法對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨近端PPARγ2蛋白表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組大鼠比較，去卵巢組大鼠脛骨近端PPARγ2蛋白表達(dá)水平顯著增加；與去卵巢組比較，雌激素組、金雀異黃酮組、氯化鋰組和跑臺(tái)組脛骨近端PPARγ2蛋白表達(dá)水平均顯著降低，振動(dòng)組脛骨近端PPARγ2蛋白表達(dá)水平未見顯著變化。

3 討論

隨著年齡的增加，眾多婦女絕經(jīng)后不僅骨量急劇下降，腹部脂肪也隨之增加，易發(fā)生骨質(zhì)疏松和代謝綜合征[12]。本研究中，大鼠去卵巢后體重和腹腔內(nèi)脂肪重量顯著增加，經(jīng)雌激素、金雀異黃酮、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和全身垂直振動(dòng)干預(yù)后，體重和腹腔內(nèi)脂肪重量均顯著下降，而經(jīng)氯化鋰干預(yù)后，體重和腹腔內(nèi)脂肪重量均未見顯著變化。結(jié)果提示：除氯化鋰外，雌激素、金雀異黃酮、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和全身垂直振動(dòng)干預(yù)處理均能顯著抑制大鼠由去卵巢導(dǎo)致的肥胖。

骨髓脂肪增加和骨量下降的相關(guān)性有助于更好地理解骨丟失的病理及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療[13]。有研究表明，去卵巢大鼠骨髓脂肪增加伴隨骨量下降[14]。Somjen等[15]的研究表明，天然的和人工合成的雌激素均能逆轉(zhuǎn)由去卵巢誘導(dǎo)的骨髓脂肪發(fā)生。我們的前期研究表明，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能抑制去卵巢大鼠骨髓脂肪數(shù)目的增加[16]。已有研究表明，氯化鋰不僅可產(chǎn)生抗成脂發(fā)生的效應(yīng)[17]，且具有促進(jìn)成骨發(fā)生的效應(yīng)[18]。本研究中，雌激素、金雀異黃酮、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)、全身振動(dòng)和氯化鋰干預(yù)8周均能顯著抑制去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨髓脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加。結(jié)果提示：雌激素、金雀異黃酮、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)、全身振動(dòng)和氯化鋰對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的干預(yù)效應(yīng)與其抗骨髓脂肪發(fā)生有關(guān)。至于干預(yù)效應(yīng)是否和促進(jìn)成骨發(fā)生有關(guān)，還有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

骨髓脂肪細(xì)胞的分化受核受體家族PPAR的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的缺乏能減少小鼠骨髓脂肪含量，加強(qiáng)成骨發(fā)生[19]。相反，成骨細(xì)胞過表達(dá)PPARγ能加快由去卵巢導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松的發(fā)生[20]。為了探討雌激素、金雀異黃酮、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)、全身垂直振動(dòng)和氯化鋰減少去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨髓脂肪數(shù)目的機(jī)制，本文采用免疫印跡方法檢測(cè)PPARγ2蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明：雌激素、金雀異黃酮、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和氯化鋰干預(yù)均能抑制去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠脛骨近端PPARγ2蛋白的表達(dá)水平，而全身垂直振動(dòng)卻無此抑制效應(yīng)。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，雌激素、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)、金雀異黃酮和氯化鋰干預(yù)均可能通過抑制去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織PPARγ2蛋白表達(dá)水平而抑制去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化，而全身垂直振動(dòng)對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)可能與PPARγ2蛋白表達(dá)水平無關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]JEREMIAH M P，UNWIN B K，GREENAWALD M H，et al.Diagnosis and management of osteoporosis[J].Am Fam Physician，2015，92（4）：263.

[2]MAEDA S S，LAZARETTICASTRO M.An overview on the treatment of postmenopausal osteoporosis[J].Arq Bras Endocrinol Metabol，2014，58（2）：168.

[3]MARAKA S，Kennel K A.Bisphosphonates for the prevention and management of postmenopausal osteoporosis[J].BMJ，2015，351：3783.

[4]WEBERRAJEK M，MIESZKOWSKI J，NIESPODZIRKI B，et al.Wholebody vibration exercise in postmenopausal osteoporosis[J].Prz Menopauzalny，2015，14（1）：44.

[5]LIU H，LIU Y，YANG L，et al.Curative effects of pulsed electromagnetic fields on postmenopausal osteoporosis[J].Journal of Biomedical Engineering，2014，31（1）：50.

[6]BERNABEI R，MARTONE A M，ORTOLANI E，et al.Screening，diagnosis，and treatment of osteoporosis：a brief review[J].Clin Cases Miner Bone Metab，2014，11（3）：204.

[7]WEBERRAJEK M，MIESZKOWSKI J，NIESPODZISKI，et al.New antiresorptive therapies for postmenopausal osteoporosis[J].J Menopausal Med，2015，21（1）：6.

[8]KUSHWAHA P，KHEDGIKAR V，GAUTAM J，et al.A novel therapeutic approach with aviuninbased isoflavonoid that en routes bone marrow cells to bone formation via BMP2/Wntβcatenin signaling[J].Cell Death Dis，2014（5）：1422.

[9]FAN J Z，WANG Y，MENG Y，et al.Panax notoginseng saponins mitigate ovariectomyinduced bone loss and inhibit marrow adiposity in rats[J] .Menopause，2015，22（12）：1347.

[10]ZHUANG H，ZHANG X，ZHU C，et al.Molecular Mechanisms of PPARγ Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation[J].Curr Stem Cell Res Ther，2016，11（3）：255.

[11]郭蓋，卜淑敏，韓天雨.不同干預(yù)療法對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠子宮GSK3β蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2014，22（5）：54.

[12]JUNG S R，KIM S H，AHN N Y，et al.A novel therapeutic approach with Caviuninbased isoflavonoid that en routes bone marrow cells to bone formation via BMP2/Wntβcatenin signaling[J].Cell Death Dis，2014（5）：1422.

[13]LI G W，XU Z，CHANG S X，et al.Influence of early zoledronic acid administration on bone marrow fat in ovariectomized rats[J].Endocrinology，2014，155（12）：4736.

[14]YAN G F，YUAN P W，HAO Y Q，et al.Emodin enhances osteogenesis and inhibits adipogenesis[J].BMC Complement Altern Med，2014（14）：74.

[15]SOMJEN D，KATZBURG S，KOHEN F，et al.The effects of native and synthetic estrogenic compounds as well as vitamin D lesscalcemic analogs on adipocytes content in rat bone marrow[J].J Endocrinol Invest，2011，34（2）：108.

[16]CHEN Y，WANG S，BU S，et al.Treadmill training prevents bone loss by inhibition of PPARγ expression but not promoting of Runx2 expression in ovariectomized rats[J].Eur Appl Physiol，2011，111（8）：1764.

[17]MAI Y，ZHANG Z，YANG H，et al.BMP and activin membranebound inhibitor（BAMBI） inhibits the adipogenesis of porcine preadipocytes through Wnt/βcatenin signaling pathway[J].Biochem Cell Biol，2014，92（3）：179.

[18]GALLI C，PIEMONTESE M，LUMETTI S，et al.GSK3binhibitor lithium chloride enhances activation of Wnt canonical signaling and osteoblast differentiation on hydrophilic titanium surfaces[J].Clin Oral Implants Res，2013，24（8）：925.

[19]ZHAO X Y，CHEN X Y，ZHANG Z J，et al.Expression patterns of transcription factor PPARγ and C/EBP family members during in vitro adipogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells[J].Cell Biol Int，2015，39（4）：462.

[20]CHO S W，YANG J Y，HER S J，et al.Osteoblasttargeted overexpression of PPARγ inhibited bone mass gain in male mice and accelerated ovariectomyinduced bone loss in female mice[J].J Bone Miner Res，2011，26（8）：1949.

[21]TANG L，CHEN Y，PEI F，et al.Lithium Chloride Modulates Adipogenesis and Osteogenesis of Human Bone MarrowDerived Mesenchymal Stem Cells[J].Cell Physiol Biochem，2015，37（1）：150.

[22]ZHANG Y，MA C，LIU X，et al.Epigenetic landscape in PPARγ2 in the enhancement of adipogenesis of mouse osteoporotic bone marrow stromal cell[J].Biochim Biophys Acta，2015，1852（11）：2514.