吳媛，谷繼偉，荊紅英，國玉芝，王晶，顏承云,△

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紫杉醇/NLS-KALA-SA核定位納米粒對肺腺癌A549細胞株的抑制作用

吳媛1，谷繼偉2，荊紅英2，國玉芝2，王晶2，顏承云1,2△

摘要:目的觀察多肽自組裝載體載紫杉醇納米粒（NKSP）及紫杉醇單藥對肺腺癌A549細胞株的體外抑制作用及可能機制。方法用噻唑藍（MTT）法分別檢測不同濃度組NKSP（20、40、80、100 μg/L）、紫杉醇單藥(20、40、80、100 μg/L)作用24、48及72 h對A549細胞增殖的影響。流式細胞儀檢測不加任何藥物處理（A）組、加入80 μg/L的多肽自組裝納米粒(NKS)培養(yǎng)液（B）組、加入80 μg/L紫杉醇單藥（C）組、加入含80 μg/L NKSP（D）組作用A549細胞48 h及72 h時的細胞凋亡率。Western blot檢測A、B、C、D組作用48 h及72 h細胞凋亡相關(guān)蛋白bax、caspase-3的表達。結(jié)果紫杉醇單藥、NKSP均能抑制A549的增殖，紫杉醇單藥各組48和72 h時、NKSP單藥各組在72 h時隨濃度遞增抑制率也呈遞增趨勢（均P < 0.05）。48 h時D組促A549凋亡作用低于C組(P < 0.05)，72 h強于C組(P < 0.05)，且藥物作用48 h時D組的bax、caspase-3的表達低于C組，而72 h時高于C組(P < 0.05)。結(jié)論NKS包裹紫杉醇后可促使載體內(nèi)的紫杉醇緩慢釋放，與紫杉醇單藥相比，可降低細胞毒性，延長抗腫瘤作用時間。

關(guān)鍵詞:肺腫瘤；腺瘤病,肺；納米球；抗腫瘤藥；體外研究；紫杉醇；A549細胞

△通訊作者E-mail: 382841156@qq.com

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,占我國城市人口死亡原因第1位[1]。對于不能手術(shù)的患者，化療為其治療的主要手段[2]。紫杉醇是常見的細胞毒性化療藥物，其對非小細胞肺癌等多種腫瘤具有良好的治療效果[3]。本課題組前期采用Fmoc多肽固相合成法依次將基因融合肽（KALA）、硬脂酸(SA)連接到核定位信號(NLS)多肽上，建立的多肽自組裝納米粒載體(NKS)能主動包裹紫杉醇等藥物[4-5]。該NLS介導(dǎo)的KALA多肽納米載體同時具有主動穿過細胞膜和跨膜轉(zhuǎn)運入核的能力，SA烷基鏈可誘導(dǎo)多肽形成更加穩(wěn)定的自組裝體。KALA穿膜作用可實現(xiàn)細胞內(nèi)吞，通過α-螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)變擾亂溶酶體的膜層，逃離內(nèi)涵體進入細胞質(zhì)，快速定位細胞核[6]。本研究旨在以NKS為載體制備紫杉醇納米粒（NKSP）緩釋制劑，探討其用于肺癌靶向治療的效果，以期提高藥物的緩釋特性及生物利用度。

1　資料與方法

1.1一般資料人肺腺癌A549細胞株（桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心保存）；紫杉醇注射液（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科提供)；NLS-KALA-SA(自制)；1640培養(yǎng)液購自gibco公司；胎牛血清購自依科賽公司；胰蛋白酶-EDTA消化液、10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠配置體系購自Solarbio公司；噻唑藍(MTT）購自華美公司；兔抗β-actin、bax、caspase-3購自萬類生物公司；羊抗兔二抗購自北京中杉金橋有限公司；酶標儀、凝膠成像系統(tǒng)購自Bio- Rad公司；BD FACSAriaⅢ流式細胞儀、AN?NEXIN V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；掃描電鏡S4800購自日本高新技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1NKSP的制備將粉末狀的NKS均勻涂抹于導(dǎo)電膠上，鍍金，在掃描電鏡S4800下觀察。將粉末狀NKS配成1 g/L的載體溶液，按照載體和紫杉醇的質(zhì)量比為1∶1配成NKSP。NKS的制作結(jié)構(gòu)式C18H36O2（SA）-WEAKLAKALAKA?LAKHLAKALAKALKACEA(KALA)-VKRKKKP（NLS），其中KALA加NLS合稱為細胞穿膜肽（CPPs）。

1.2.2細胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細胞，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。

1.2.3MTT實驗檢測紫杉醇單藥及NKSP對A549細胞增殖的影響取對數(shù)生長期的A549細胞，胰蛋白酶消化，用1640完全培養(yǎng)液重懸成單個細胞懸液，以每孔5 000個細胞接種于96孔板中，每孔體積100 μL，培養(yǎng)24 h后，分設(shè)對照組（不加任何藥物處理）和實驗組，實驗組分為不同濃度藥物組（NKSP濃度分別為20、40、80及100 μg/L），紫杉醇（濃度分別為20、40、80及100 μg/L），每個濃度組分設(shè)6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48及72 h；每孔加入5 g/L MTT 20 μL, 37℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育4 h,加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO）終止反應(yīng),在37℃恒溫振蕩10 min, 450型ELISAReader酶標儀（Bio-Rad公司）490 nm單波長檢測吸光度，計算各藥物濃度對A549細胞增殖的抑制率。細胞抑制率(%) =(1-藥物組吸光度/對照組吸光度)×100%。實驗重復(fù)3次。計算紫杉醇單藥及NKSP作用48 h時及72 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，設(shè)A、B、C、D 4個組。A為空白對照組，不加任何藥物處理的組；B組加入80 μg/L NKS的培養(yǎng)液；C組加80 μg/L紫杉醇單藥；D組加入含80 μg/L NKSP，每組分別處理細胞48 h及72 h。待達到培養(yǎng)時間后，用胰蛋白酶消化，離心，收集細胞。用冷PBS洗滌、離心細胞2次（1 000 r/min，5 min），用1×Bind Buffer重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL ,取100 μL上述細胞懸液，避光條件下每組加入5 μL FITC和5 μL PI染料，15 min后每組加入400 μL 1×Bind Buffer，用流式細胞儀檢測，F(xiàn)ACSDiva Version 6.1.3軟件分析結(jié)果。每組重復(fù)測3次。

1.2.5Western blot法觀察凋亡相關(guān)蛋白bax、caspase-3的表達細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分組及干預(yù)措施同1.2.4。各組分別作用48 h及72 h后，用胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗2遍，收集細胞,加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清，以BCA法獲得蛋白質(zhì)定量值后沸水煮10 min備用。配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠,恒壓80 V電泳,恒流240 mA轉(zhuǎn)膜1 h，常溫下5%牛奶封閉2 h,一抗β-actin、bax、caspase-3（1∶500），4℃孵育過夜,二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光。用Uvp grabit Image軟件測定各條帶的吸光度,以各組目的條帶的吸光度值與內(nèi)參β-actin吸光度值的比值作為細胞間蛋白表達量的比較。每組重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，同種藥物2個不同時間點的比較用獨立樣本t檢驗。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較用bonferroni法，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1NKS的形貌圓形顆粒為NKS納米粒，放大倍數(shù)為30 000倍，放射電流9 800 nA，見圖1。

Fig. 1 The morphology of blank carrier（NKS）in SEM（×30 000）圖1　掃描電鏡下空白載體(NKS)的形貌（×30 000）

2.2紫杉醇單藥及NKSP對A549細胞增殖的影響組間比較：紫杉醇和NKSP單藥各濃度組間作用24 h時差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其對A549細胞無生長抑制作用，后續(xù)實驗及組內(nèi)比較排除24 h數(shù)據(jù)；48、72 h時各組抑制率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.05），NKSP 20 μg/L與40 μg/L組間在48 h抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。組內(nèi)比較：紫杉醇和NKSP單藥各濃度組72 h抑制率均高于48 h（均P < 0.05），見表1。紫杉醇單藥作用48 h和72 h時的IC50分別為64.8和63.2 μg/L。NKSP作用48 h時和72 h 的IC50分別為123.3和59.4 μg/L。后續(xù)實驗為了取一個中間濃度，故選藥物濃度為80 μg/L。

Tab.1 The inhibitory rates of A549 cells treated by various concentrations of paclitaxel monotherapy and NKSP monotherapy表1　各濃度組紫杉醇單藥和NKSP單藥作用A549細胞的抑制率?。╪=3,%，±s）

2.3流式細胞儀檢測結(jié)果48 h時，C組與D組的細胞凋亡率均高于A組和B組，D組低于C組；72 h時，C組、D組高于A組B組，而D組高于C組（P < 0.05）。48 h及72時A組和B組凋亡率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2、圖1。

Tab. 2 The apoptotic rates after 48 h and 72 h treatment in four groups表2　各組分別作用48 h及72 h后的凋亡率（n=3,%,±s）

Tab. 2 The apoptotic rates after 48 h and 72 h treatment in four groups表2　各組分別作用48 h及72 h后的凋亡率（n=3,%,±s）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F 48 h凋亡率1.467±0.404 1.733±0.472 53.333±8.514ab32.133±7.800abc57.329＊＊72 h凋亡率3.300±0.700 3.467±0.750 59.900±3.651ab72.300±6.755abc267.292＊＊

2.4Western blot檢測結(jié)果除72 h時A、B組bax差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其他各組間bax和caspase-3比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中48 h時C組bax、caspase-3蛋白的表達量高于D組；72 h時低于D組（均P < 0.05），見圖2、表3。

Fig. 1 The apoptotic results of flow cytometry in four groups of A549 cells圖1　流式檢測各實驗組對A549凋亡的影響

Fig. 2 Results of Western blot assay for apoptotic proteins bax and caspase-3 in four groups圖2　Western blot檢測各組對凋亡蛋白bax、caspase-3的影響

Tab. 3 Comparison of the expression amount of bax and caspase-3 after 48 h or 72 h treatment between four groups表3　各組48 h及72 h時bax、caspase-3表達量的比較（n=3，±s）

Tab. 3 Comparison of the expression amount of bax and caspase-3 after 48 h or 72 h treatment between four groups表3　各組48 h及72 h時bax、caspase-3表達量的比較（n=3，±s）

＊＊P < 0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F bax 48 h 0.032±0.019 0.091±0.029a1.522±0.797ab1.109±0.549abc625.818＊＊72 h 0.797±0.248 0.785±0.150 4.660±0.448ab5.964±0.572abc121.368＊＊caspase-3 48 h 0.300±0.017 0.411±0.022a1.156±0.057ab0.522±0.026abc366.394＊＊72 h 0.669±0.038 0.100±0.050a1.466±0.048ab1.689±0.084abc190.238＊＊

3　討論

與其他生物大分子轉(zhuǎn)運方式相比，細胞穿膜肽(CPPs)作為分子載體應(yīng)用于體內(nèi)外的入胞轉(zhuǎn)運具有很多優(yōu)勢。首先，細胞穿膜肽能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)具有不同分子質(zhì)量和天然性質(zhì)的大分子進入細胞；其次，細胞穿膜肽毒性相對較小[7]。該多肽分子中引入SA烷基鏈可以穩(wěn)定α-螺旋肽的二級結(jié)構(gòu)，并誘導(dǎo)多肽形成更加穩(wěn)定的自組裝載體。

紫杉醇是從紅豆杉樹皮中提取的具有抗癌作用的天然的廣譜抗腫瘤藥物。它通過促進細胞微管蛋白聚合，維系已聚合微管蛋白穩(wěn)定，抑制細胞有絲分裂來實現(xiàn)抗腫瘤作用[8]。紫杉醇是常見的細胞毒性化療藥物，常用于肺癌的治療，不良反應(yīng)有骨髓抑制、超敏反應(yīng)、心臟毒性等[9]。

本研究MTT實驗結(jié)果顯示，紫杉醇和NKSP單藥各濃度組間作用24 h時差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明各組A549細胞無生長抑制作用，考慮原因可能為藥物作用時間較短，藥效發(fā)揮；NKSP各濃度組72 h抑制率均高于48 h，且在72 h時隨著濃度的增大對A549的抑制作用也增強，表明NKSP可在體外抑制肺腺癌A549細胞的增殖，抑制作用具有濃度依賴性。流式細胞儀可以在大量凋亡細胞和壞死混合的條件下，快速、定量和準確地檢測細胞活力[10]。本研究結(jié)果顯示，48 h時紫杉醇單藥導(dǎo)致的細胞凋亡率高于NKSP,而72 h時低于NKSP；48 h及72時B組凋亡率和A組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明NKS本身并沒有導(dǎo)致A549凋亡的作用；而D組高于C組，提示NKSP藥物具有緩釋作用，同時又具有高效性，在同樣濃度下能達到更好抑制腫瘤細胞的作用。Western blot實驗顯示，48 h紫杉醇單藥組bax、cas?pase-3的表達量高于NKSP組，而72 h低于NKSP組，表明NKSP可能通過上調(diào)bax、caspase-3表達水平，來誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡，提示NKSP對基因的調(diào)控速度相對單藥紫杉醇起始較慢，但是隨著作用時間的延長，其作用明顯增強并且作用時間更加持久。

綜上所述，筆者認為，NKS包裹紫杉醇后，可促使載體內(nèi)的紫杉醇緩慢釋放，從而降低了細胞毒性，延長了抗腫瘤作用時間。故NKSP有望成為抗腫瘤治療的一種新藥。

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（2015-07-02收稿2015-07-22修回）

（本文編輯陸榮展）

作者單位：1廣西桂林，桂林醫(yī)學(xué)院研究生院（郵編541004）；2黑龍江佳木斯，佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院

Inhibition effects of paclitaxel/NLS-KALA-SA nanoparticles on A549 cell line in vitro

WU Yuan1, GU Jiwei2, JING Hongying2, GUO Yuzhi2, WANG Jing2, YAN Chengyun1,2△
1 Guilin Medical University, Guilin 541004, China; 2 First Affiliated Hospital of Jiamusi University
△Corresponding Author E-mail：382841156@qq.com

Abstract:Objective To observe NLS-KALA-SA-PTX (NKSP) for lung adenocarcinoma cell line A549 in vitro with paclitaxel monotherapy, and the mechanism thereof. Methods MTT assay was used to detect A549 cell proliferation influ?enced by different concentrations of NKSP (20, 40, 80, 100 μg/L) and paclitaxel monotherapy (20, 40, 80, 100 μg/L) for 24 h, 48 h and 72 h.. Subsequent experiments were divided into four groups, namely, group A (without any drug treatment), group B (added polypeptide 80 μg/L of self-assembled nanoparticles, NKS), group C (80 μg/L paclitaxel monotherapy) and group D (80 μg/L NKSP). Flow cytometry was used to detect the cell apoptotic rates after 48 h and 72 h treatment in four groups. Western blot assay was used to analyse the protein expressions of bax and caspase-3 after 48 h and 72 h treatment in four groups. Results Both paclitaxel monotherapy and NKSP can inhibit the proliferation of A549 cells. The inhibitory rates of paclitaxel monotherapy group at 48 h and 72 h and NKSP group at 72 h showed an increasing trend in a dose-depen?dent manner (P < 0.05). After treatment for 48 hours, the apoptotic rate was significantly higher in D group than that of C group (P < 0.05). But the apoptotic rate at 72 h was lower in D group than that of C group (P < 0.05). The protein expressions of bax and caspase-3 at 48 h were significantl lower in D group than those of C group, which were higher at 72 h in D group than those of C group (P < 0.05). Conclusion Compared to paclitaxel monotherapy group, NKS promotes slow release of pa?clitaxol, which reduces the cytotoxicity and extends the antitumor effects.

Key words:lung neoplasms；adenomatosis, pulmonary；nanospheres；antineoplastic agents；in vitro; paclitaxel; A549 cells

中圖分類號:R734.2，R979.1

文獻標志碼:A

DOI:10.11958/59151

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81260484)；廣西自然科學(xué)基金資助項目(2013GXNSFAA019226)

作者簡介：吳媛（1990），女，碩士研究生在讀，主要從事腫瘤靶向研究